抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达与鉴定

为提高抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中可溶性表达量,本研究利用克隆技术得到四价抗体基因sc-sa,将该融合基因连接至表达载体pTO-T7的Ω序列和T7启动子下游,构建成功的表达质粒导入大肠杆菌OrigamiB(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,Ni亲和层析纯化蛋白,间接非竞争ELISA法测定该四价抗体的亲和力。结果表明在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中表达分子量约为46kDa的四价抗体,0.1mmol/L的IPTG在30℃条件下诱导原核表达,外源蛋白占菌体总蛋白含量近50%,纯化后可溶性蛋白纯度在90%以上,ELISA结果显示该抗体与对硫磷结合呈阳性,抗体效价在1∶1×106以上,亲和常数为6.84×108L/mol。与母源抗体和相应单链抗体相比,利用pTO-T7载体四价抗体在大肠杆菌OrigamiB(DE3) 中可实现高效表达,且抗体效价和亲和力均得到进一步提高。     

电子束辐照对花生过敏原免疫原性及生化性质影响的研究

研究了电子束辐照降低花生过敏原免疫原性的效果及辐照对花生生化性质的影响。选择2、4、6、8、10、15和20kGy剂量的电子束对花生过敏原液、脱脂花生粉进行辐照处理,辐照后花生主要过敏原(Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3)蛋白分子质量的变化通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,免疫原性的变化通过免疫印迹和间接竞争ELISA法测定;辐照后花生过敏原溶液的浓度、浊度及疏水性的变化通过紫外分光光度计和荧光光度计分别进行测定。结果表明,花生过敏原在溶液状态比固体状态对辐照更为敏感。当辐照剂量低于10kGy时处理的过敏原液的免疫原性稍有增强,剂量大于10kGy时免疫原性降低,剂量为20kGy时过敏原液的IC₅₀值是未处理的11倍。辐照使过敏液的浓度和浊度随着剂量的加大而增加,疏水性与对照组相比增强,但当剂量大于15kGy时降低。电子束辐照改变了过敏原的生化性质,降低了其免疫原性,比较而言,辐照对液体状态下过敏原的影响更显著。     

Pen a 1表位抗原多克隆抗体的制备及鉴定

【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的（85—105位）含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为 12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(icELISA)测定该多克隆抗体对多肽的IC50和IC10分别为0.4324 μg•mL-1和0.0004 μg•mL-1,表明多克隆抗体对多肽具有较强的灵敏性。免疫印迹试验结果表明,此多克隆抗体仅可识别刀额新对虾蛋白中的Pen a 1蛋白,对所选其它物种蛋白无响应。【结论】通过人工合成多肽制备的抗体可用于目标致敏蛋白质的检测分析,该方法快捷灵敏,且具有较高的特异性。