RAMP与REMAP分子标记技术及其应用

引物设计是RAMP和REMAP标记分析的关键，二者都使用锚定的微卫星序列引物。目前已开发出多个RAMP锚定微卫星序列引物，与不同的RAPD引物进行扩增，得到更多的引物组合。REMAP使用反转录转座子的外向LTR引物和锚定微卫星序列引物。而RAMP分析采用不对称PCR循环，在PCR扩增的后15个循环中，退火温度设为2个；REMAP则采用常规PCR循环。扩增产物可在聚丙烯酰胺凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶上进行电泳分离，检测时可使用同位素、银染或溴化乙锭染色等技术。目前，这两种标记技术已在作物和动物种质资源的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、转基因植株基因稳定性分析等方面都有成功的应用。     

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子———模板DNA、引物、dNTPs和Mg2 浓度进行优化,建立起适合于萝卜基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(18μl)为随机引物0.4~0.6μmol/L,dNTPs0.15~0.2mmol/L,Mg2 2.0mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.8U;ISSR反应体系(16μl)为引物0.5μmol/L,dNTPs0.16mmol/L,Mg2 2.5mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验,表明35~42℃(37℃)与52.4~58.3℃(55℃)分别适于萝卜基因组DNA的RAPD-PCR和ISSR-PCR反应;应用优化的RAPD和IS-SR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。     

萝卜肉质根膨大过程中糖含量及蔗糖代谢相关酶活性分析

用根冠比差异显著的萝卜品系为材料,研究了肉质根膨大过程中的若干生理生化变化。结果表明：4个品系肉质根的库活性变化情况基本一致,“破肚”后一周内达到最大;可溶性总糖、果糖和蔗糖含量初期下降,“破肚”期降至最低值,其中低根冠比品系“NAU-LR-04”蔗糖含量一直高于其它高根冠比品系,而其果糖含量则相对较低。肉质根中蔗糖合酶的活性变化与肉质根库活性的变化趋势基本一致,且低根冠比品系蔗糖合酶活性相对高于高根冠比品系,推测蔗糖合酶可能是调节肉质根蔗糖水平、控制肉质根库活性的关键酶。     

萝卜mRNA差异显示技术反应体系的优化及应用

以萝卜品种短叶十三为材料,对影响mRNA差异显示(DDRT-PCR)反应体系的主要因子进行优化试验,最终确定了优化体系(15μl):随机引物0.5μmol/L,锚定引物1.0μmol/L,dNTPs 0.1~0.2 mmol/L,Mg2 1.5mmol/L,模板cDNA 15 ng,TaqDNA聚合酶0.9 U;并对PCR扩增程序中的复性温度进行梯度筛选,表明40℃较适合于萝卜mRNA差异显示(DDRT-PCR)反应体系。同时应用该优化体系分别对短叶十三花芽分化和扬花萝卜、春萝卜BYC抽薹过程中基因的差异表达进行初步分析。     

萝卜自交不亲和特性的荧光快速鉴定

以萝卜高代自交系为材料,利用荧光显微镜观察其花期和蕾期自花授粉的柱头与花柱,结果发现自交不亲和与自交亲和材料花粉萌发和花粉管伸长状况存在明显差异.自交不亲和材料花期授粉后柱头上出现严重的胼胝质反应,花粉很少萌发,即使萌发也不能正常生长,出现弯曲或背向生长,花粉管顶端膨大不能穿越柱头乳突细胞;自交亲和系萝卜单株花期、蕾期以及自交不亲和系单株蕾期授粉后花粉多数能够正常萌发并穿越柱头进入子房.对供试材料进行了田间自交亲和指数测定,结果与荧光显微镜测定法鉴定结果高度一致.因此利用荧光显微镜观察法可以准确快速鉴定萝卜的自交不亲和性,从而提高优良自交不亲和系选育效率.     

萝卜自交不亲和特性的荧光快速鉴定

以萝卜高代自交系为材料,利用荧光显微镜观察其花期和蕾期自花授粉的柱头与花柱,结果发现自交不亲和与自交亲和材料花粉萌发和花粉管伸长状况存在明显差异.自交不亲和材料花期授粉后柱头上出现严重的胼胝质反应,花粉很少萌发,即使萌发也不能正常生长,出现弯曲或背向生长,花粉管顶端膨大不能穿越柱头乳突细胞;自交亲和系萝卜单株花期、蕾期以及自交不亲和系单株蕾期授粉后花粉多数能够正常萌发并穿越柱头进入子房.对供试材料进行了田间自交亲和指数测定,结果与荧光显微镜测定法鉴定结果高度一致.因此利用荧光显微镜观察法可以准确快速鉴定萝卜的自交不亲和性,从而提高优良自交不亲和系选育效率.