绵羊子宫内膜上皮细胞的纯化培养与鉴定

为了探索一种分离纯化绵羊子宫内膜上皮细胞的简便高效方法,本试验采用先组织块培养后消化纯化和直接消化后过筛纯化两种方法对绵羊子宫内膜上皮细胞进行培养、纯化,最后用免疫荧光方法对上述方法得到的细胞进行角蛋白检测从而鉴定上皮细胞纯度。结果表明先组织块培养后消化纯化法可以得到纯度95%,且形态均一、活性良好的绵羊子宫内膜上皮细胞;先消化后过筛纯化法得到的子宫内膜上皮细胞形态良好但是纯度仅为70%,与前一方法相比有待提高。因此,先组织块培养后消化纯化法是获得绵羊子宫内膜上皮细胞的一种简单易行且高效的方法,该方法得到的细胞可以在体外传至3-4代。     

利用脂质体法建立转Toll样受体4基因大尾寒羊胎儿成纤维细胞株的研究

利用脂质体转染法获得转Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)基因的成纤维细胞,将其作为供体细胞,再通过体细胞核移植技术构建重构胚,最终生产出转TLR4基因且性别可控的大尾寒羊。本研究通过原代培养大尾寒羊胎儿皮肤成纤维细胞,并进行SRY基因性别鉴定,利用脂质体转染法转入TLR4基因,然后分别从形态学与分子水平检测TLR4基因的表达,将稳定表达转TLR4的成纤维细胞核移植入绵羊去核卵母细胞中构建重构胚。最终获得5个稳定表达TLR4的阳性细胞克隆,经SRY基因性别鉴定为雌性细胞株,通过实时荧光定量PCR分析,在第4代转染的细胞中TLR4表达量最高,比未转染细胞高出7.4816倍(P<0.01),卵裂的重构胚中有EGFP的表达。试验成功构建出含TLR4基因的重构胚,为今后生产出性别可控的抗病转基因绵羊地方新品种奠定基础。     

中国荷斯坦奶牛TBX21基因与产奶性状及体细胞数的遗传效应分析

为鉴定与奶牛产奶性状和乳房炎抗性相关的遗传标记,为将来的分子育种提供理论基础,以383头中国荷斯坦母牛(均为2胎牛)为研究对象,利用直接测序法及飞行时间质谱法首次寻找TBX21基因5'和3'侧翼区的SNP位点,进而对这些多态性位点与中国荷斯坦牛4个泌乳性状(305天产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率)和体细胞数进行关联分析。结果表明:在TBX21基因5'和3'侧翼区存在2个SNP位点,一个是在3'侧翼区1091 bp处A→G的突变,一个是3'侧翼区654 bp处A→C的突变;这2个位点均处于哈代-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡状态。关联分析结果表明,rs207725545位点AA基因型个体的4种泌乳性状和体细胞数均高于CC型个体(P0.05);rs110420592位点GG基因型个体的产奶量和乳糖率高于AA型个体(P0.05),AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率高于GG型个体(P0.05),而GA基因型个体的体细胞数略高于其他2种基因型个体(P0.05)。因此,在本试验群体中,TBX21基因的rs110420592和rs207725545两个位点与产奶性状和体细胞数无显著关联,后续需要扩大群体对TBX21基因的其他位点进行遗传效应分析。     

牛抑制素α亚基基因克隆及表达载体的构建

为克隆牛抑制素α亚基基因,构建抑制素pET32a-成熟肽表达载体,从河北大厂县屠宰场采集卵巢,提取总RNA并反转录成cDNA,根据GenBank NM_174094.4 设计一对引物扩增出成熟肽cDNA,将所扩增基因插入到pET32a 表达载体BamHⅠ与HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒抑制素pET32a-成熟肽。结果成功构建出抑制素α亚基基因。笔者初步得到了抑制素重组质粒,为今后重组蛋白原核表达的研究奠定了基础。     

外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的影响

了研究外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的作用,通过向成熟培养液中添加10 μg/mL FSH +10 μg/mL LH（对照组）和0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL的外源性孕酮,对牛卵丘卵母细胞复合体进行体外成熟培养,在培养8 h后用醋酸地衣红染色观察各自的生发泡破裂率,然后在成熟22 h统计第一极体率,体外受精后7~8天统计囊胚率。结果表明,对照组卵母细胞的生发泡破裂率(75.0%)和极体率(79.6%)均明显高于添加不同浓度孕酮的各处理组(P<0.05),而囊胚率各组之间均无显著差异(P>0.05)。因此,外源性孕酮不能促进牛卵母细胞的核成熟,单独添加外源性孕酮不能起到与内源性孕酮相同的作用。     

microRNAs调控动物骨骼肌发育的研究进展

microRNAs(miRNAs)是一类重要的内源性非编码小分子RNA,参与调控机体生长、发育的各个环节。近年研究表明,miRNAs在动物骨骼肌发育过程中发挥着重要的调节作用。本文综述了目前已发现的调控动物骨骼肌发育的关键miRNAs。