猪β2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建

【目的】利用重组β₂肾上腺素能受体（β₂AR）检测β₂激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β₂ AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β₂AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β₂AR核苷酸序列（AF000134）,设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造;为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp 左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β₂AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β₂AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β₂AR（AF000134）相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99.28%,3处发生突变,且配体与受体结合位点处的氨基酸均得到正确克隆。在线BLAST分析表明,猪与其它物种的β₂AR及氨基酸序列一致性均在80%以上,具有较高的同源性。由系统进化树分析可知,所克隆的猪β₂AR与领西猯Pecan tajacu（JN 633666.1）的亲缘性较近,与大仓鼠Tscherskia triton（AY683091.1）和草原田鼠Microtus ochrogaster（XM 005356183.1）的亲缘性较远。氨基酸疏水性分析表明,该受体蛋白N端以疏水性氨基酸为主,C端以亲水性氨基酸为主。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析证明,成功构建重组穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418。【结论】所获克隆基因与已发表猪β₂AR高度一致,且活性位点处的氨基酸均得到正确克隆。此外,pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体适宜用作大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统的启动子,是研究目标基因在不同表达系统表达效果的良好材料。本文所构建的穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418均可用于以上3种表达系统中β₂AR蛋白的表达纯化研究。     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

猪圆环病毒1型北京株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的免疫保护研究

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的免疫效力,检测了PCV1-2免疫诱导仔猪产生抗猪圆环病毒II型(PCV2)感染的保护性免疫。将10头28日龄健康普通仔猪随机平均分成两组,一组肌注免疫106.05TCID50 PCV1-2作为免疫组;另一组不予免疫作为对照。到免疫后28天,免疫组仔猪血清中PCV2 ORF2蛋白抗体全部转为阳性。在免疫后28天,所有仔猪经口鼻予以106.95TCID50 PCV2攻击。攻毒后,免疫组仔猪全部保持临床健康,而对照组仔猪全部出现了PCV2疾病的临床症状;免疫组血清和淋巴组织中PCV2 DNA载量均显著(P<0.05)减少;对照组仔猪淋巴组织普遍出现中度到重度的淋巴细胞减少与组织细胞浸润,而免疫组没有。研究数据表明：PCV1-2免疫诱发了仔猪对PCV2感染的保护性免疫,有望成为候选PCV2弱毒疫苗。     

一株新基因型猪圆环病毒II型的鉴定

为了解新近出现的猪圆环病毒II型(PCV2)的基因变异及其基因型信息。用PCR技术从新近发生断奶后多系统消耗综合征的病猪组织中扩增和克隆出一株PCV2全基因组序列,并进行了遗传变异分析。结果显示：该PCV2毒株基因组全长为1767 bp,与部分其他PCV2毒株的核苷酸同源性达94.0%以上,并显示出一定的地域、时间相关性。病毒ORF2基因系统发育进化分析显示：该PCV2毒株与已有PCV2基因型的遗传距离均大于0.035,因而被划入到一个新的PCV2基因型,暂命名为PCV2d,属于在中国新近出现的一种PCV2基因型。研究结果表明,克隆鉴定了一株新基因型PCV2。     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的致病性与免疫原性

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的致病性与免疫原性,检测了健康普通仔猪接种PCV1-2后的临床症状、病理变化、血清与组织中的病毒含量及血清学变化。结果显示,仔猪接种PCV1-2后增重和饲料转化效率未受影响,未出现可见的临床症状和大体病理变化,仅部分出现轻微的组织病理变化。血清中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白抗体在接种后第14天出现阳转,第28天时抗体阳性率达到100%,表明PCV1-2诱发仔猪快速产生了针对PCV2 ORF2蛋白抗原的特异性抗体反应。荧光定量PCR结果显示,血清中PCV1-2 DNA含量在接种后逐渐上升,第28天时达到最高,之后迅速下降;第35天宰杀时组织中病毒含量以肺门淋巴结中最高,心脏中最低;而常规PCR难以检出血清和组织中的PCV1-2 DNA,表明PCV1-2接种后只引起仔猪的轻微感染。研究数据表明,PCV1-2对仔猪具有良好的免疫原性,其致病性明显减弱。     

猪圆环病毒1型天津株全基因组的克隆与序列分析

摘要：【目的】从天津地区分离和克隆出1株PCV1,并进行基因组序列分析。【方法】参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从天津一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。【结果】全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长1759 bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性达98.2%以上。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别为97.5%~99.8%和92.7%~99.9%。【结论】虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但还是呈现出一定的地域相关性。     

DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。