猪圆环病毒河南株的分离鉴定

【研究目的】为了研究猪圆环病毒的分子生物学特征及其发病机理和致病机制,【研究方法】将疑似猪圆环病毒2型的猪脾脏、淋巴结用胰蛋白酶消化处理后接种PK-15细胞,盲传6代后,病毒已经适应PK-15细胞,【研究结果】然后设计一对特异性引物利用PCR技术扩增出ORF2片段中540 bp的基因。第6代细胞病毒液经间接免疫荧光检测表明,在荧光显微镜下可见PCV特征的荧光斑,表明毒株具有感染性。【结论】将病毒纯化后进行电镜观察,病毒粒子直径约17nm,圆形,无囊膜,研究结果表明分离的病毒为猪圆环病毒。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型（PCV1）ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1 ORF2全基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明：所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1 ORF2基因的同源性介于97.3% ~ 99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9% ~ 68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒II型ORF4真核表达载体构建及其抗体制备

为构建猪圆环病毒II型(PCV2) ORF4基因的真核表达载体,并制备ORF4抗体。用PCR方法扩增PCV2 ORF4基因,将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)或pEGFP-C1,成功构建出重组质粒pCDNA-ORF4、pEGFP-ORF4。重组质粒pEGFP-ORF4转染PK15细胞后,pEGFP-ORF4蛋白在细胞中明显表达,荧光信号主要定位于细胞核内。重组质粒pCDNA-ORF4接种BALB/c小鼠后,接种小鼠血清能与PCV2发生特异性免疫反应,经4次接种后抗体效价均达到1:26以上,表明诱导产生了PCV2 ORF4抗体。研究结果表明,构建了2种PCV2 ORF4真核表达载体,并制备了PCV2 ORF4抗体,为PCV2 ORF4基因功能研究奠定了基础。     

类猪圆环病毒2型因子P1和P2诱导PK-15细胞凋亡的研究

为了研究类猪圆环病毒2型因子P1和P2体外诱导的细胞凋亡作用,将P1和P2分子克隆分别转染PK-15细胞。结果表明,用透射电镜可以观察到P1和P2诱导PK-15细胞出现凋亡的典型形态学变化。     

口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定

利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。     

PCV2逃逸宿主天然免疫的分子机制研究

为了探究PCV2抑制β干扰素(IFN-β)的分子机制,采用相对荧光定量的方法检测了PCV2感染PK-15细胞及PAM细胞后的白细胞介素、抗原提呈分子、模式识别受体、干扰素及其转录因子、DNA信号通路关键接头分子的转录表达,结果表明,PCV2感染引起β干扰素下调为主的天然免疫抑制。采用IFN-β启动子的荧光素酶报告检测系统检测PCV2感染PK-15细胞后IFN-β的表达情况,结果显示,PCV2感染不能激活IFN-β的转录,并且能够抑制Poly(d A∶d T)诱导的IFN-β转录,呈现PCV2接种剂量依赖性;为了探究PCV2编码的主要蛋白在天然免疫中的作用,构建了PCV2ORF1/ORF2/ORF3 pc DNA3.1真核表达载体,采用IFN-β-Luc、NF-кB-Luc、AP-1-Luc和IRF3-Luc启动子的荧光素酶报告系统检测PCV2 ORF1、ORF2、ORF3对干扰素的影响作用,结果显示,PCV2感染抑制IFN-β的产生,但其编码的蛋白ORF1和ORF2在调控方面特性相反,ORF1能够通过NF-кB激活干扰素,ORF2则可以通过IRF3、NF-кB抑制干扰素,ORF3对干扰素通路的影响不明显。研究表明,PCV2 ORF2可通过抑制干扰素产生影响机体先天性免疫反应。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

河北地区猪圆环病毒二型ORF2基因片段的克隆与原核表达

以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV20RF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌B121(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析.结果表明.重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性.     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的免疫保护研究

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的免疫效力,检测了PCV1-2免疫诱导仔猪产生抗猪圆环病毒II型(PCV2)感染的保护性免疫。将10头28日龄健康普通仔猪随机平均分成两组,一组肌注免疫106.05TCID50 PCV1-2作为免疫组;另一组不予免疫作为对照。到免疫后28天,免疫组仔猪血清中PCV2 ORF2蛋白抗体全部转为阳性。在免疫后28天,所有仔猪经口鼻予以106.95TCID50 PCV2攻击。攻毒后,免疫组仔猪全部保持临床健康,而对照组仔猪全部出现了PCV2疾病的临床症状;免疫组血清和淋巴组织中PCV2 DNA载量均显著(P<0.05)减少;对照组仔猪淋巴组织普遍出现中度到重度的淋巴细胞减少与组织细胞浸润,而免疫组没有。研究数据表明：PCV1-2免疫诱发了仔猪对PCV2感染的保护性免疫,有望成为候选PCV2弱毒疫苗。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

猪圆环病毒1型天津株全基因组的克隆与序列分析

摘要：【目的】从天津地区分离和克隆出1株PCV1,并进行基因组序列分析。【方法】参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从天津一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。【结果】全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长1759 bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性达98.2%以上。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别为97.5%~99.8%和92.7%~99.9%。【结论】虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但还是呈现出一定的地域相关性。     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的致病性与免疫原性

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的致病性与免疫原性,检测了健康普通仔猪接种PCV1-2后的临床症状、病理变化、血清与组织中的病毒含量及血清学变化。结果显示,仔猪接种PCV1-2后增重和饲料转化效率未受影响,未出现可见的临床症状和大体病理变化,仅部分出现轻微的组织病理变化。血清中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白抗体在接种后第14天出现阳转,第28天时抗体阳性率达到100%,表明PCV1-2诱发仔猪快速产生了针对PCV2 ORF2蛋白抗原的特异性抗体反应。荧光定量PCR结果显示,血清中PCV1-2 DNA含量在接种后逐渐上升,第28天时达到最高,之后迅速下降;第35天宰杀时组织中病毒含量以肺门淋巴结中最高,心脏中最低;而常规PCR难以检出血清和组织中的PCV1-2 DNA,表明PCV1-2接种后只引起仔猪的轻微感染。研究数据表明,PCV1-2对仔猪具有良好的免疫原性,其致病性明显减弱。     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。     

应用纳米磁珠实时荧光PCR检测非洲木薯花叶病毒

建立非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)灵敏快速的纳米磁珠实时荧光PCR检测技术,防止其传入中国。采用TaqMan探针结合纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)技术,以外壳蛋白基因为目标基因,通过特异性及灵敏度试验建立MNP荧光PCR检测方法。成功建立了非洲木薯花叶病毒(ACMV)的MNP荧光PCR检测方法;该方法检测阈值约为13 pg DNA,比普通PCR及ELISA方法灵敏度高25倍;该方法具有良好的特异性,能够有效区分双生病毒属的ACMV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)及番茄严重曲叶病毒(ToSLCV)。MNP荧光PCR方法能够快速灵敏的检测茎叶样品中的ACMV,无需任何PCR后处理,交叉污染风险小,适于口岸检验检疫。     

猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。