金花茶花朵和叶片UPLC-QTOF-MS分析

[目的]鉴定分析金花茶花朵和叶片中主要化学成分、含量及其变化特征,为金花茶资源的进一步开发利用提供科学依据。[方法]利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS)技术定性定量分析金花茶花瓣、雄蕊、老叶和新叶中花青苷、类黄酮及儿茶素类成分与含量。[结果]花青苷天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷均为金花茶中首次发现,其中,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷仅存在于紫红色新叶中。类黄酮木犀草素-7-O-芸香糖苷和染料木苷为金花茶中首次发现,槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷为金花茶叶片中首次发现。金花茶花瓣与雄蕊中花青苷相差不大,但却低于叶片尤其新叶;花朵中儿茶素类远高于叶片尤其新叶。金花茶花瓣和雄蕊中总黄酮及槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷均相差不大,但却远高于叶片。金花茶新叶中主要类黄酮成分木犀草素-7-O-芸香糖苷及总类黄酮明显高于老叶。[结论]金花茶中共鉴定出2种花青苷、6种类黄酮和2种儿茶素;槲皮素-3-O-葡萄糖苷等类黄酮是金花茶花朵呈现黄色的主要原因,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是金花茶新叶呈现紫红色的主要原因。     

山茶芽变花色与花青苷的关系

目的 研究山茶芽变花色与花青苷的关系,为山茶花色的芽变育种提供科学依据。方法 按照CIE L* a* b*表色系法测量山茶及其芽变品种的花色,利用高效液相色谱-光电二极管阵列检测（HPLC-DAD）和超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）联用技术定性定量分析其花瓣中花青苷成分与含量,运用多元线性回归方法研究花青苷与花色之间的关系。结果 山茶及其芽变品种花瓣中共检测到7种花青苷,分别是矢车菊素-3-O-β-半乳糖苷（Cy3Ga）、矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cy3G）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-咖啡酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaECaf）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-咖啡酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GECaf）、矢车菊素-3-O-[6-O-(Z)-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GZpC）、矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpC）和矢车菊素-3-O-[6-O-(E)-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpC）。山茶各系列芽变品种中,白色花瓣中均未检测到花青苷,红色花瓣中花青苷成分与粉色花瓣相同,但红色花瓣中各成分含量及花青苷总量均远高于粉色花瓣;红色和粉色花瓣中主要花青苷成分为Cy3G和Cy3GEpC;红色花瓣中Cy3G和Cy3Ga所占比例大于粉色花瓣,而Cy3GEpC等花青苷比例小于粉色花瓣。结论 山茶各系列芽变品种中各种花青苷含量及花青苷总量越大,花瓣红色越深;Cy3G、Cy3Ga和Cy3GEpC是决定山茶芽变花色的主要花青苷成分,其含量的积累增加花瓣红色程度。     

杜鹃红山茶CaAPX基因的克隆、表达及功能分析

[目的]利用分子生物学技术探讨杜鹃红山茶CaAPX基因的表达模式及在模式植物烟草中所起的抗寒、耐热作用,为今后山茶花抗逆育种奠定基础。[方法]根据山茶花同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3’,5’-RACE技术,从杜鹃红山茶嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(APX),命名为CaAPX,基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量PCR对杜鹃红山茶7种组织和温度胁迫下该基因的表达模式进行分析。[结果]表明:CaAPX基因在杜鹃红山茶7种组织中均得到表达,但表达水平不一,表达量由高到低依次为:未成熟果实嫩叶花苞叶芽种胚花瓣花芽,其中,未成熟果实中的表达量是其它组织的2.6811.44倍;温度胁迫处理8 h后该基因呈上调表达,CaAPX基因表达量分别是0 h的3.49和2.67倍。CaAPX基因转化烟草分析表明,过量表达CaAPX基因后,APX活性提高了2.58 4.09倍,抗坏血酸(As A)含量提高了2.673.56倍,并且转基因烟草植株的抗寒、耐热能力也获得提高。[结论]通过过量表达CaAPX基因能够提高烟草植株的抗寒、耐热性,为山茶花抗逆育种提供了科学依据。     

茶花红叶芽变品种‘金华美女’叶色突变相关主要化学成分含量变化

‘金华美女’是从‘贝拉大玫瑰’中选育出的茶花芽变品种,其主要特点是叶色呈现暗红色。分别测定了上述两个品种在4个不同发育阶段叶片叶绿素、类胡萝卜素、总花青苷、矢车菊素葡萄糖苷、总多酚、儿茶素和表儿茶素含量。结果表明:(1)在相同阶段,两个品种间叶绿素a和叶绿素b差异均不显著。认为红叶品种的叶绿素合成途径也正常,排除因叶绿素变异引起的叶色变异;(2)红叶品种‘金华美女’叶片中的类胡萝素含量显著低于绿叶品种‘贝拉大玫瑰’,可见其积累对‘金华美女’的叶色无影响;(3)在4个时期中,‘金华美女’叶片总多酚、儿茶素和表儿茶素的平均含量仅占‘贝拉大玫瑰’叶片中的相应含量的33.1%、42%和15%,可见变色品种叶片的多酚合成途径可能受到一定程度的阻碍。(4)‘金华美女’叶片中总花青苷平均含量达3.06 mg·g~(-1),是‘贝拉大玫瑰’的7倍。由此可见,叶片花青苷合成途径中红色类组分的积累和多酚合成途径中无色类组分的合成受阻,是引起‘金华美女’叶色变红的主要成因。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

山茶C功能基因CjPLE的克隆及在重瓣品种中的表达模式分析

经典ABC模型中的C功能基因是决定花内轮雄蕊和雌蕊器官的重要因子,也是花分生组织终止分化的调控基因。以野生"红山茶"(Camellia japonica)为材料,克隆了C功能基因CjPLE(MF278983),其c DNA全长为901 bp,开放阅读框780 bp;染色体步移实验表明其基因结构中含有两个内含子;系统进化树分析发现它与番茄TAG1和金鱼草PLE等基因组成PLE亚类。荧光定量PCR的结果显示,该基因在野生"红山茶"的心皮中有很高的表达量;在牡丹型重瓣的品种"红露珍"和"状元红"中,雄蕊中的表达量最高,而在"绒球"的内轮花瓣和雄蕊中都有较高的表达量。以上结果表明Cj PLE是山茶属C功能基因PLE分支点同源基因,并可能在调控重瓣花的花器官属性决定形成中发挥作用。     

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。      

过量表达杜鹃红山茶CaAPX1的烟草耐热性提高

根据山茶(Camellia japonica)同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3′,5′-RACE技术,从杜鹃红山茶(C.azalea)嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因,命名为CaAPX1(Gen Bank登录号:KP635267),基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量分析发现,CaAPX1在4种不同的山茶中均得到表达,其中较耐热的微花连蕊茶(C.minutiflora)表达量最高,其次是中等耐热的杜鹃红山茶和‘耐冬’山茶(C.japonica‘Naidong’),最低的为耐热性较差的‘恨天高’云南山茶(C.reticulata‘Hentiangao’)。结果表明该基因的表达量高低与测试物种的耐热性有关。CaAPX1在杜鹃红山茶4种组织中均得到表达,表达量由高到低依次为:叶片、花蕾、种胚、花芽,其中叶片表达量高达其他组织的1.29~4.26倍。CaAPX1转基因烟草分析表明,过量表达CaAPX1后,APX酶活性提高了2.58~3.81倍,抗坏血酸(Ascorbate,AsA)含量也提高了2.67~3.56倍,并且转基因烟草植株及其种子的耐热能力也提高。     

油茶果实生长发育动态和木质素积累规律

【目的】研究6种不同油茶材料果实生长发育动态和木质素积累规律变化,鉴定油茶果实发育期,明确不同类型油茶果实形态差异形成过程以及木质素对油茶果实发育的影响。【方法】以小果油茶(Camellia meiocarpa)、攸县油茶(Camellia yuhsienensis)、普通油茶(Camellia oleifera)长林53号和长林166号、浙江红花油茶(Camellia chekiangoleosa)和茶梨油茶(Camellia octopetala)6种不同油茶材料为研究对象,对成熟油茶果实性状、果实生长发育动态以及木质素积累规律进行观测,结合观测结果对油茶果实发育时期进行了鉴定。【结果】不同类型油茶果实形态和质量相关指标均存在显著性差异,油茶果实鲜果含仁率从大到小依次为攸县油茶(19.72%)、普通油茶长林53号(16.99%)、小果油茶(14.85%)、普通油茶长林166号(12.32%)、浙江红花油茶(6.22%)和茶梨油茶(3.32%)。油茶果实发育都经历了类似S型的3个阶段:前期果实大小和质量变化缓慢,中期发育较快,后期逐渐平稳。浙江红花油茶和攸县油茶分别是果实成熟时期最早和最晚的油茶类型。小果油茶、普通茶油和茶梨油茶果实发育周期基本一致。不同类型油茶果实不同生长发育阶段的持续时间、形态和质量变化规律具有各自特点。油茶果皮发育经历了"增厚-延展"的过程,不同类型油茶果皮增厚与延展的起始时间、终止时间和持续时间存在一定差异,油茶果皮延展的时期与果实生长发育迅速的时间吻合。果皮发育以果皮完全木质化的时期作为分界线,可以分为增厚期和延展期。种子发育分别以种子填充种皮空间、种仁成型和种皮完全木质素化为分界线,分为发育前期、种仁形成期和种子膨大期3个时期。油茶果实果皮和种皮组织(种壳)都具有木质素积累,除浙江红花油茶外,其余5种类型油茶果皮中木质素积累的方式都是从外向内,呈射线状,逐渐充满整个果皮组织中。【结论】果皮发育的差异是导致不同类型油茶果实形态差异的主要原因,油茶果皮木质化过程影响了果实发育,木质素积累越早,果皮厚度越薄,果实越小。种子的最终形态与种皮中的木质素积累情况具有直接关系。     

托桂型茶花‘金盘荔枝’中花器官发育基因CjAG1的克隆与功能分析

为探讨山茶重瓣花形成的机理，在山茶A和B类基因研究的基础上，通过同源基因查找分析，从山茶（Camellia japonica）重瓣品种‘金盘荔枝’（‘Jinpan Lizhi’）早期花芽中克隆了长度为1 418 bp的C类基因CjAG1全长cDNA序列（Genbank登录号JX843816），包括长度为224 bp的5′非编码区、768 bp的编码区和426 bp的3′非编码区三部分。基因编码的蛋白质包含258个氨基酸残基，属于不稳定亲水性蛋白，α-螺旋和无规则卷曲构成了其结构骨架。Real-time P