基于环介导等温扩增技术检测雪松疫霉根腐病菌

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Milbrath)是一种重要的毁灭性植物病原菌,也是我国进境植物检疫性有害生物。目前,我国未有该病害发生的报道,为了防止P.lateralis的传入和扩散,需对其进行快速、准确的检测。本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以Ypt1基因为靶标序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系,并对灵敏度和特异性进行检测。结果表明:整个检测过程仅需80 min,即可通过肉眼观察直接判定检测结果。在特异性检测中,P.lateralis菌株都能观察到天蓝色的阳性反应,而其他疫霉菌和真菌供试菌株均呈阴性反应。在灵敏度检测中,最低检测限为100 pg/μL。该方法的建立为P.lateralis的检疫鉴定及其所致病害的快速诊断提供了新技术。     

LAMP快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病

[目的]水稻恶苗病是为害水稻生长发育的重要病害,在我国的分布非常广泛,经常会造成严重的损失。拟轮枝镰孢是引起水稻恶苗病的重要病原菌,本研究意在建立由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断技术。[方法]基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase)基因Pgk为靶标,设计筛选LAMP特异性引物。[结果]建立了可直接从水稻恶苗病植株中检测拟轮枝镰孢并诊断由该病原菌引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术(FvPgk-LAMP)。该检测技术可以从田间发病的水稻植株中直接对病原菌进行检测,反应条件为62℃、70 min。由于反应前在反应管内加入了羟基萘酚蓝(HNB),反应结束后可对结果进行直接判定,阳性反应呈天蓝色,阴性反应则仍然为紫色。该体系的最低检出限为目标菌纯DNA的100pg·μL~(-1)。应用该技术我们已成功且快速地对来自江苏南京和镇江的水稻恶苗病样本进行了病害诊断。[结论]本研究为拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的诊断提供了快速且有效的新技术。     

基于SPI指数的惠州市干季干旱趋势分析

本研究依据 1971—2017年 10月到次年 3月惠州市气象观测站降水资料, 运用标准化降水指数(SPI)、 M-K突变检验和小波分析等指标分析了惠州市干季的干旱趋势。结果表明： 1971—2017年, 惠州市干季总降水量在 1971—2004年呈下降趋势, 而 2004—2017年呈显著的增加趋势; 干季干旱情况以正常为主, 而季节性干旱表现为以轻微干旱为主, 中等干旱次之, 并未出现严重干旱以及极端干旱的情况;干季干湿转换表现为突变现象, 1975年为湿润到干旱转变的突变年, 而 2015年为干旱到湿润转变的突变年; 惠州干季干湿震荡主周期为 15~32年和 5~15年, 近 46年 10年左右的时间尺度上存在着 7次干湿交替, 且小波系数大于 0的等值线到 2017年并未完全闭合, 表明未来几年惠州干季仍处于湿润化趋势阶段。     

高效液相色谱质谱联用法测定饲料中的三聚氰胺

通过对提取液、净化方式的优化,色谱柱的选择建立饲料中三聚氰胺的高效液相色谱质谱联用法．针对相应的提取液用正交试验筛选最佳的提取方案。样品经乙腈水溶液（70：30．V/V）超声提取。离心后取上清液与等体积乙腈混匀．冷冻离心后直接过滤膜即可上机测定。经Waters Atlantis HIUC Silica（150mm×2．1mm,5um）分离,选择反应监测（SRM）正离子模式测定。结果表明,该方法在三聚氰胺含量为5．0～50．0ng／mL范围内线性关系良好．线性方程为Y=8958．7X-3327．8．R2=0．9996以三倍信噪比计算方法最低检出限为0．01mg／kg．平均加标回收率为：91．7％～98．5％,RSD〈5．0％。该法前处理快速简便,净化效果好。准确度和精密度高,可用于饲料中三聚氰胺的测定。     

基于环介导等温扩增技术快速诊断由Fusarium andiyazi引起的水稻恶苗病

水稻恶苗病是水稻上的重要病害,在我国各水稻主要种植区均有发生,造成水稻产量的严重损失。Fusarium andiyazi是近年来国外报道的水稻恶苗病的病原菌之一,本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAM P),以F.andiyazi的TAT(trichothecene 3-O-acetyltransferase)基因为靶标设计并筛选出一套灵敏、特异的LAM P引物,建立了可快速诊断该病菌所引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术。在等温条件下(64℃)只需进行核酸扩增反应80 min,反应前向体系中加入了金属离子指示剂HNB(羟基萘酚蓝),反应后即可肉眼观察反应产物颜色变化判断检测结果,阳性反应呈天蓝色,阴性呈紫色。该TAT-Fan-LAMP技术的最低检测灵敏度为100 pg·μL~(-1)。应用该技术成功地对南京江宁和镇江句容田间采集的由F.andiyazi引起的水稻恶苗病进行快速诊断。该LAMP检测技术的建立为F.andiyazi引起的水稻恶苗病的诊断提供了简便快速的新技术。     

基于环介导等温扩增技术检测东北地区大豆主要品种(系)种子携带的病原菌

为了解东北地区大豆种子携带病原菌的情况,选取了该地区52个大豆主要品种(系),采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测其种子携带胶孢炭疽菌、平头炭疽菌、冬青丽赤壳菌、亚细亚镰孢菌、黄色镰孢菌、木贼镰孢菌、禾谷镰孢菌、层出镰孢菌、尖镰孢菌、茄腐镰孢菌、轮枝镰孢菌、接骨木镰孢菌、大豆炭腐病菌、大豆拟茎点种腐病菌、大豆疫霉菌和立枯丝核菌16种大豆主要病原菌的状况。结果表明:在其中38个品种(系)的种子样本中累计检测出上述8种病原菌,检出率由高到低依次为:大豆拟茎点种腐病菌、立枯丝核菌、木贼镰孢菌、亚细亚镰孢菌、禾谷镰孢菌、层出镰孢菌、尖镰孢菌和平头炭疽菌。不同大豆品种(系)种子带菌的种类及数量存在较大差异,其中品种绥12-18和29182被检出的病原菌多达4种。本研究对了解东北地区大豆种子携带病原菌的状况有参考价值,并为大豆种子带菌检测提供了新的方法。     

异甘草素抗腹泻活性及其分子机制研究

为确定异甘草素抗腹泻作用及其抗腹泻分子机制,利用蓖麻油诱导小鼠腹泻模型评价异甘草素抗腹泻活性,观察并记录初次腹泻时间、腹泻次数及肠道碳粉推进比等相关指标.通过网络药理学方法分析异甘草素治疗腹泻关键靶标,利用分子对接技术及荧光定量PCR确定异甘草素对靶标的影响.结果表明,灌胃异甘草素显著降低小鼠腹泻次数,延缓初次腹泻时间,减慢肠道蠕动.网络药理学研究表明,MAPK14、NCOA2、PPARG和ESR1可能是异甘草素治疗腹泻关键靶点,异甘草素下调上述基因表达,分子对接表明异甘草素可与关键蛋白结合,是一种潜在抑制剂.     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL~(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。