外源ATP对盐胁迫下油菜种子萌发及幼苗生长的影响

以‘陇油8号’油菜为试验材料,研究了不同浓度(1、10、25、50、100μmol·L~(-1))外源ATP预处理对盐胁迫下油菜种子萌发及幼苗生物量、H_2O_2和·OH含量、抗氧化酶活性、膜损伤程度、渗透调节物质及相关基因表达的影响。结果表明,与对照(不用ATP或NaCl处理)相比,用不同浓度的外源ATP处理,可不同程度地提高油菜种子的发芽率和发芽势,25μmol·L~(-1)的ATP处理表现较为显著,发芽率和发芽势分别提高了26.9%和17.2%。25μmol·L~(-1)的ATP+NaCl处理相比较于单独NaCl胁迫处理,油菜种子的发芽率和发芽势分别提高了13.7%和15.0%,油菜幼苗的生物量(根长、株高、鲜重)、2种抗氧化酶活性(CAT、POD)、可溶性糖和脯氨酸含量及相关基因(MAPK3和MAPK6、SOS1和NHX1)的表达量均显著增加,其中根长、株高、鲜重分别增加了23.6%、27.3%、28.6%,CAT、POD活性、可溶性糖和脯氨酸含量分别增加了10.3%、27.0%、15.9%、41.0%;而H_2O_2和·OH含量、丙二醛(MDA)含量及相对电导率分别显著降低了13.6%、6.3%、27.6%、20.5%。以上结果表明,外源ATP浸种能够促进NaCl胁迫处理下油菜的种子萌发,显著提高幼苗的生物量、抗氧化能力及相关基因的表达,降低其膜损伤,增强油菜幼苗的耐盐性。     

白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物, 采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA, 获得APX基因开放阅读框, 长度为753 bp, 编码250个氨基酸残基, 推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示, 与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达到99%, 该酶蛋白具有高度的进化保守性, 其保守序列属于植物的POD超家族, APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽, 是一个亲水性蛋白, 可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示, 该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导, 表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性的影响

为了研究褪黑素（MT）对低温胁迫下油菜幼苗抗性的影响，以白菜型油菜“陇油6号”为试验材料，研究了外源MT对低温胁迫下黄瓜幼苗丙二醛（MDA）含量、相对电导率、叶绿素含量、活性氧（ROS）含量、抗氧化酶活性和MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达的影响。结果显示:与单独的4℃胁迫处理相比，100 μmol·L^-1褪黑素预处理后再进行低温胁迫处理不同的时间（12、24、36、48 h），油菜幼苗MDA含量、相对电导率和ROS含量均显著降低，其中MDA和相对电导率分别降低了14.3%、15.0%、17.2%、20.0%和11.5%、12.8%、16.2%、15.1%，而叶绿素含量、三种抗氧化酶活性（CAT、POD、SOD）和MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达均增加，其中CAT的活性分别增加28.5%、23.1%、7.6%、13.1%，POD和SOD的活性分别增加36.0%、25.3%、5.9%、18.7%和14.6%、18.6%、9.1%、13.6%。表明低温胁迫下，100 μmol·L^-1外源MT预处理可以显著降低油菜幼苗MDA含量、ROS水平和电解质的渗漏，增加叶绿素含量和抗氧化酶系统的活性，诱导MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达，降低质膜过氧化水平，保持细胞膜的完整性，增强油菜幼苗对低温的适应性。     

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。     

白菜型油菜‘陇油6号’ COR15-like基因的克隆与表达

为探究COR基因在油菜抵御逆境胁迫中的作用,采用RACE技术从白菜型油菜‘陇油6号’克隆获得1个新的COR15-like基因BrCOR15,该基因全长616bp,其中,5′非翻译区59bp,3′非翻译区167bp,开放阅读框390bp,编码129个氨基酸,推测其蛋白分子质量为13.9ku,理论等电点为5.2。该基因编码蛋白质的氨基酸序列与多种植物具有较高一致性,与拟南芥AtCOR15、AtCOR15a,高山离子芥CbCOR15,高山葶苈DaCOR15a、DaCOR15b的氨基酸序列一致性分别为74.6%、77.7%、72.3%、77.9%和76.7%。实时荧光定量PCR分析表明,BrCOR15基因在油菜的茎、叶和下胚轴均有表达,无组织特异性;该基因表达受低温、ABA和H2O2诱导,与单独处理结果相比,经MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA和H2O2处理后,BrCOR15基因的表达量明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA和H2O2胁迫过程中发挥作用。     

植物褪黑素功能及其作用机制的研究进展

褪黑素是一种重要的植物生长调节剂，在植物中具有多种功效。鉴于褪黑素在植物中的多种功能作用，为了给褪黑素在农业生产中的应用提供理论依据，通过查阅并梳理相关文献，阐述了植物中褪黑素的合成及代谢途径，褪黑素对植物生长发育的调控及对植物响应逆境胁迫的影响和褪黑素诱导作用的机制。褪黑素不仅参与植物种子萌发、根系发育、开花结果等生长发育过程，还能充当胁迫缓解剂，调节植物对多种生物胁迫/非生物胁迫的响应，且用外源褪黑素处理能够有效地缓解低温、干旱、盐碱以及病虫害等对植物的损伤程度，今后的研究应将盆栽试验与田间试验结合起来，以加速褪黑素在农业中的广泛应用。