革兰阴性菌外膜囊泡的研究进展

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是革兰阴性(G^-)菌从细胞膜上脱落下来的囊泡,携带有细菌的大量组分,如外膜蛋白、脂多糖、脱氧核糖核酸等。由于OMVs无活性、不能复制且具有免疫原性,所以被认为是最具潜力的亚单位疫苗,同时OMVs对细菌本身具有多种作用,故OMVs成为研究的热点。本文从G^-菌OMVs的组成成分、形成机制、生物学功能、提取纯化方法及其开发应用前景5个方面综述其研究现状,为G^-菌的致病机制研究、OMVs的疫苗开发应用提供技术指导。     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

非洲猪瘟病毒LNA引物PCR检测方法的建立及优化

为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×10¹ copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。     

脂多糖修饰对革兰阴性菌毒力及外膜囊泡生物学特性影响的研究进展

脂多糖(LPS)是革兰阴性(G^-)菌的内毒素,刺激机体引发炎症反应,为细菌的一种毒力因子,主要存在于细菌细胞壁外膜上,也是外膜囊泡(OMVs)的主要成份。OMVs是细菌从膜上脱落下来的一种囊状结构,含有大量的LPS、外膜蛋白及其他成分,具有良好的免疫原性,被认为是最具潜力的亚单位疫苗。大多数LPS由类脂A、核心寡糖和O抗原多糖组成,这3个组分的合成影响着LPS的结构,继而影响细菌的毒力和细菌分泌OMVs的产量、毒性及免疫原性等生物学特性。论文主要对LPS的合成转运过程中结构修饰对G^-菌毒力及其OMVs生物学特性的影响进行综述,为革兰阴性菌致病机理研究及开发新型亚单位疫苗提供新思路。     

抗结肠小袋纤毛虫中草药的体外筛选

利用机率单位法,从30种中草药中筛选出16种半数致死浓度(LC50)低于100g/L的中草药,分别是五倍子、常山、乌梅、葛根、百部、二花、甘草、黄芩、知母、槟榔、苦楝皮、诃子、贯众、使君子、巴豆和青蒿,可作为抗结肠小袋纤毛虫候选中草药,做进一步研究。     

猪流行性腹泻病毒变异株GDqy2017的分离及S和ORF3基因序列分析

2017年广东某猪场送检腹泻死亡仔猪小肠样本,经实验室检测、细胞分离及RT-PCR鉴定,确定分离到1株猪流行性腹泻病毒,命名为GDqy2017,克隆并测定其S基因与ORF3基因序列,并对序列进行分析。结果显示,该分离株对Vero细胞高度适应,第1代即出现细胞病变(CPE),第4代起1d内即出现CPE,且CPE时间和形态稳定。其S基因长4 158nt,与经典毒株CV777、中国疫苗株CV777及韩国疫苗株attenuated DR13核苷酸同源性为94.2%、94.1%、94.2%,氨基酸同源性为93.4%、92.7%、93.0%,存在2处插入、2处缺失及98处突变(与经典毒株CV777相比),属于不同进化群,与国内2010年后参考株(除CHXBC-01-2015、CH/GDQY/2011)在同一进化群,S蛋白的主要抗原表位存在突变,其中有1处新突变出现(640位F→S),其ORF3全长675nt,不存在疫苗株中的大片段缺失及表达截短现像,但存在突变,进化树分析显示与经典毒株CV777、疫苗株属于不同进化群,亲缘关系较远。研究结果为后续PEDV分子生物学分析、流行病学调查及研制更为有效的疫苗提供基础数据。     

副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。【方法】以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD₆₀₀-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B 纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。【结果】成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。【结论】lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。     

猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43%~0.64%、0.44%~2.34%,重复性良好。对67份临床样品进行检测,病毒分离培养法检测出23份阳性样品,LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测出26份阳性样品,常规TaqMan探针法检测出21份阳性样品,与病毒分离法比较,LNA-TaqMan探针法的符合率为96%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针检测猪伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法,为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术支持。     

革兰氏阴性病原菌外膜囊泡的生物学作用与机制研究进展

外膜囊泡（Outer membrane vesicles,OMV）是兰氏阴性菌分泌的纳米样颗粒。OMV 呈球状双层膜结构,直径为 20~250 nm 大小。其主要由细菌的外膜成分构成,其中病原菌分泌的 OMV 包括与致病相关的多种成分,如非蛋白抗原脂多糖、脂质、蛋白质粘附素、侵袭素、毒素等致病因子。病原菌 OMV 还含有细菌的DNA、RNA、sRNA 和质粒等核酸,是革兰氏阴性菌的一种新型分泌系统,与致病性、耐药基因的存储和传播、细菌间及细菌 - 宿主间通信串扰等一系列功能紧密相关。病原菌 OMV 的分泌与应激反应有关。OMV 作为毒力因子、耐药基因或质粒、抗原分子等生物活性物质的载体递送至宿主细胞,直接导致疫病的发生或加剧病情。在作用机制方面,OMV 通过动力依赖性内吞将毒素转运至宿主细胞、介导耐药基因水平转移、通过增加分泌量减少噬菌体入侵病原菌,或保护来源菌、周围细菌免受膜活性物质侵害、影响,以及诱导细菌感染部位甚至远部组织免疫相关细胞的免疫反应、激活炎症反应通路、介导宿主细胞死亡及代谢重构等。鉴于 OMV 在细菌致病、耐药性产生、宿主生理屏障（肠黏膜屏障、肠血管屏障、血脑屏障）破坏及生态位失衡、免疫功能异常等方面发挥的多种生物学功能,深入了解其相关生物学作用和潜在的分子机制,对探索人和动物细菌病的致病机制、耐药机理、开展药物靶向递送系统研发及新型疫苗创制等防控新策略具有重要意义。重点对 OMV 在革兰氏阴性病原菌致病过程中的作用及分子机制相关研究进展进行综述,并对其应用进行展望。