不同生长素类型及ABA搭配对小麦幼胚再生效果的影响

生长素是小麦幼胚产生胚性愈伤组织的关键成分,培养基中适宜的生长素种类、浓度和组合决定着小麦幼胚再生效果。本研究以小麦基因型CB037幼胚为材料,在分别确定dicamba、2,4,5-T和picloram的适宜用量的基础上,比较了2,4-D、dicamba、2,4,5-T、picloram在适宜浓度下诱导再生的效果,筛选...     

一种改良的棉花总DNA提取方法

为了获取高质量的棉花基因组DNA,进行了后续分子实验,通过对已有的几种DNA提取方法进行综合比较,寻找一套优化的适于棉花高质量DNA的提取方法。结果表明,优化的棉花基因组DNA提取方法所提取的DNA纯度高,无降解现象,适用于进行常规PCR扩增以及进行高精度要求的SSR扩增。     

小麦TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

植物VIP1蛋白(Vir E2 interacting protein 1)与农杆菌侵染植物后T-DNA在细胞内的转运有关,影响植物转化效率,但还未见有关小麦中VIP1基因研究的报道。本研究利用in silico技术从普通小麦中克隆了TaVIP1家族基因,该家族基因全部由4个外显子构成,编码产物相似性高,与拟南芥AtVIP1蛋白质序列相似性仅为50.7%~51.4%。Southern杂交结果表明,TaVIP1基因在小麦基因组中存在3个拷贝。根据小麦3个TaVIP1基因的差异序列设计特异引物,以四倍体小麦Langdon与中国春D组染色体代换系为材料进行PCR检测,结合生物信息学分析,将小麦3个TaVIP1基因分别定位在4AL、4BS和4DS染色体上。亚细胞定位分析表明,TaVIP1蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核中。农杆菌转化烟草,过表达TaVIP1基因降低了烟草转化效率。小麦TaVIP1基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtVIP1基因及烟草NtVIP1基因编码的氨基酸序列相似性很低,这可能是小麦农杆菌转化效率低的原因之一。     

小麦Wcor15基因上游调控区克隆及生物信息学分析

为了克隆小麦Wcor15基因启动子序列和预测可能的表达调控途径,试验设计特异引物采用PCR方法从小麦基因组DNA中直接进行扩增并测序,用Neural Network Promoter Prediction、Promoter SCAN、Promoter 2.0和Meth Primer软件对启动子结构进行分析,PLACE在线分析预测可能的顺式作用元件。结果表明:克隆获得了一段长度为2 046 bp的Wcor15基因上游调控区序列,软件预测显示该区域含有4个可能的启动子,除了具有一般启动子的CAAT-box、TATA-box典型结构外,还含有CBFHV、ACGTATERD1、ABRELATERD1、ARR1AT、CANBNNAPA应答非生物胁迫、激素等重要作用元件。序列比对发现小麦Wcor15启动子与拟南芥cor15a、大麦cor14b的一致性分别为36.92%和40.29%。     

小麦流式分选染色体的鉴定

构建染色体BAC文库对于简化拥有庞大基因组植物的测序、物理作图和基因克隆具有重要意义。分选染色体的鉴定是整个文库构建过程的关键环节之一。 本文在前人研究的基础上, 分别采用荧光原位杂交(FISH)、原位PCR(C-PRINS)和PCR方法, 对分选的6VS、3B和7BL染色体(臂)进行了鉴定。结果表明, 这3种方法都能对流式分选染色体进行有效鉴定, 其中PCR法速度最快、重复性好, 但结果不具可视性、也不能鉴定分选纯度; 而FISH法重复性好、结果具有可视性、能够鉴定分选纯度, 但操作程序复杂耗时, 受探针特异性的限制; C-PRINS法则综合了上述两种方法的优点, 是最具潜力的鉴定方法, 如果与液体原位杂交相结合, 有可能为解决染色体分选问题开辟新的途径, 但也存在重复性差、杂交信号不稳定的缺点。     

以小麦根尖分生组织细胞核及染色体制备高分子量DNA

为了克服以叶片为材提取HMW DNA的局限性,优化了一套简便、实用的提取方法。该法以细胞周期同步化处理的根尖分生组织为材,利用机械匀浆释放细胞核或中期染色体制备悬浮液,再以蔗糖密度梯度离心和流式分选技术分别分离细胞核和染色体,经去蛋白、酶切,透析获得HMW DNA。经检测,来自200条根尖（10个胶块）的HMW DNA的浓度约为4~20 ng/µL,而连接、转化后的BAC克隆平均插入片段超过100 kb。证明该法适用于提取HMW DNA以构建BAC文库。     

小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析

利用in silico及反向PCR技术, 从小麦中克隆了亚硝酸还原酶编码基因及其调控序列, 进一步利用原核诱导表达、半定量RT-PCR、AS-PCR及生物信息学手段对克隆的新基因进行鉴定及染色体定位分析。开放阅读框预测结合测序结果表明, 该基因gDNA长2 881 bp, 包含4个外显子和3个内含子, cDNA长1 830 bp, GenBank登录号分别为FJ555239和FJ527909, 预测编码产物大小约为65.7 kD, 与NCBI已公布的亚硝酸还原酶基因编码产物同源性达60%以上, 其中与其他单子叶谷类作物同源性达80%以上。IPCR技术延伸该基因5′端侧翼序列至-2 924 bp (以ATG起始计算), 经1 mmol L^-1 IPTG诱导后可表达大小约为70 kD的蛋白(含约3.8 kD的组氨酸标签)。RT-PCR结果显示, 30 mmol L^-1 KNO₃处理小麦幼苗1 h, 亚硝酸还原酶基因表达量最高。酶活性测定表明, 随着KNO₃处理时间延长亚硝酸还原酶活性增强。AS-PCR检测发现, 该基因在普通小麦6A及6B染色体上至少各存在1个拷贝。     

植物组织培养再生相关基因鉴定、克隆和应用研究进展

离体植物组织体细胞胚胎发生是一个复杂的无性繁殖过程，依次经历外源植物激素信号应答、已分化细胞的脱分化、静止细胞的再分裂以及特定组织、器官原基或分生组织的形成等，是多个基因在外界因素刺激下协调、有序表达和互作的结果，不但受培养基中植物激素和营养成分的影响，也与外植体的生理状态关系密切。本文综述了外源激素和内源激素在植物组织培养中的作用，以及外源激素对内源激素的调节功能；重点介绍了5类与植物体细胞胚胎发生有关的候选基因，包括体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶、阿拉伯葡聚糖酶、亚硝酸还原酶、生长素结合蛋白和抗氧化酶。再生相关基因的利用不但有助于提高植物组织培养植株再生率和遗传转化率，而且有助于获得安全型转基因植物，在基因工程育种中具有潜在应用前景。不同植物和同种植物不同外植体组织培养中调控体细胞胚胎发生的主效基因可能不同，关键再生相关基因的克隆和功能鉴定是今后需要加强的方向。     

大豆TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制

植物TRK-HKT家族基因广泛介导植物Na+/K+运输,参与植物耐逆境胁迫调控。本研究以6个大豆钾利用效率差异品种为材料,利用in silico技术克隆到4个大豆TRK-HKT家族成员(Gm HKT1;1、Gm HKT1;2、Gm HKT1;3和Gm HKT1;4),采用q RT-PCR技术解析这些基因在低钾及逆境胁迫下的表达机制。结果表明,Gm HKT1;2在大豆幼苗根中对低钾胁迫的响应明显高于其他3个基因,且钾高效大豆品种这种响应更明显;同时Gm HKT1;2对不同逆境胁迫(低温、干旱、高盐和ABA)也有较强的响应。蛋白结构分析表明,仅Gm HKT1;2具有4个MPM结构域,4个保守的氨基酸残基空间上形成一个"漏斗样"结构,充当K+/Na+转运通道,通过邻近的ATP结合结构域,为K+/Na+转运提供能量。基因结构分析显示,这些基因均含3个外显子和2个内含子,不同基因间的第一个外显子和内含子片段大小差异显著,导致各基因的基因组DNA(g DNA)大小各异。启动子分析揭示,大豆TRK-HKT家族成员包含参与种子功能定位和各种激素及逆境胁迫应激反应的重要顺式作用元件;进化上该家族基因位于第一进化分支,含保守的Ser–Gly–Gly–Gly基序。     

植物多基因转化研究进展

随着植物基因工程和分子生物学研究的深入,植物遗传改良手段不断创新。在植物转基因方面,单个目的基因的转化已经不足以满足植物改良的需要,尤其是对一些代谢途径或数量性状的遗传修饰,多基因转化研究应运而生,并迅速发展。以烟草、水稻、玉米 等几种高等植物为例,概述了利用农杆菌介导法和基因枪介导法开展多基因转化的进展,以及存在的问题,展望了今后的发展方向,可为小麦等主要农作物多基因转化提供参考,促进转基因作物新品种培育。