核盘菌分枝酸变位酶同源效应蛋白启动子的克隆及功能分析

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。     

刺五加FPS基因DNA序列和启动子的克隆与分析

为获得刺五加FPS的DNA和启动子序列,以及其功能元件信息和基因结构,根据已克隆的FPS cDNA序列设计引物,使用TAIL-PCR技术克隆FPS的基因组DNA及启动子序列,再通过各生物软件分析基因结构与启动子功能元件。得到刺五加FPS基因全长为7 952 bp,含有12个外显子和11个内含子,启动子序列含有25个类型功能元件,包括:62个TATA-box、24个CAAT-box,以及其他类型的重要功能元件34个。本研究首次克隆得到刺五加FPS的DNA序列和启动子全长,获取了内外显子的分布情况以及启动子功能元件,为后续进一步研究FPS在刺五加中的表达调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

龙眼叶片中CHI和CHS基因启动子序列的克隆与分析*

摘要：为探明龙眼叶片CHI和CHS基因在类黄酮物质合成过程中的作用,本研究应用染色体步移技术,克隆了642bp的 CHI启动子序列CHI-P和613bp的CHS启动子序列CHS-P。利用PlantCARE软件对克隆获得的启动子序列进行分析,结果表明CHI-P和CHS-P均含有核心启动子元件TATA-Box和CAAT-Box。Box I,ABRE,G–Box元件是CHI-P和CHS-P共有的顺式作用元件,这些元件的功能包括参与脱落酸响应（ABRE）与光反应,说明CHI和CHS的表达可能都受到脱落酸和光的调控。此外,CHI-P和CHS-P序列中含有的其他元件说明CHI和CHS的表达还与植物激素及外界环境的诱导密切相关。     

刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

为探明Cf9基因的表达调控元件和同源基因进化关系,从樱桃番茄品种京番红星中克隆了Cf9上游序列,利用PlantCARE启动子预测工具对转录起始位点上游1500 bp序列进行顺式调控元件分析。结果表明,Cf9启动子不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,而且含有光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等。Cf9基因可能受光、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。Cf9同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.65时,番茄、马铃薯、辣椒、烟草中含有Cf9同源基因,同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因,分析结果也进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒、烟草。     

小麦高亲和性钾转运蛋白基因HKT1启动子克隆及序列分析

根据普通小麦HKT1 cDNA序列(GenBank登录号:U16709)设计基因特异引物,通过筛选矮败中国春BAC文库,获得含有HKT1基因组序列单克隆BAC。根据HKT1 5’-端已知序列设计测序引物,以单克隆BAC质粒为模板进行测序,序列经Sequencer软件拼接,获得了HKT1基因起始密码子上游4 192 bp序列。用Neural Network PromoterPrediction(NNPP)软件分析此序列,预测存在9个转录起始点。PLACE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件CANNTG和CCGAC等,伤害诱导元件TGACY,组织特异表达元件ACTTTA和ATATT等。HKT1启动子克隆表明,设计基因特异引物筛选BAC文库,通过以单克隆BAC质粒为模板直接测序获得基因启动子序列的方法是从普通小麦基因组中克隆基因启动子的一条切实可行的途径。     

油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。     

巴西橡胶树HbSIP1基因启动子的克隆和序列分析

为研究橡胶焦磷酸酶基因的表达特征及其在天然橡胶生物合成中调控机理,根据巴西橡胶树焦磷酸酶基因HbSIP1序列,利用GenomeWalker方法对HbSIP1基因启动子序列进行了分离,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了含有该序列的植物表达载体pSIP1-1381Z。结果表明：分离获得了1198 bp的HbSIP1基因启动子序列,该序列具有真核生物典型启动子结构特征,并含有众多应答激素和胁迫信号的调控元件。对HbSIP1的启动子区的克隆和分析,为进一步研究HbSIP1的功能和表达调控机制奠定基础。     

茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶（SMT,GenBank登录号： DQ480337）的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明SMT基因全长5473bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件,激素响应元件和抗逆性相关元件,通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-obx外,还有其它重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

桃PG基因启动子克隆及序列分析

为获得桃多聚半乳糖醛酸酶( PG)基因启动子并分析调控元件,以桃品种大久保基因组DNA为模板,采用染色体步移技术克隆了PG基因的部分序列及其5′侧翼区,并分析其调控元件组成。结果表明,克隆产物长986 bp,3′侧翼序列与 GenBank中的PG基因序列的5′端部分序列同源性为96%,登录号为FJ940722。在789~839 bp位置存在基础启动子序列,转录起始位点位于828 bp的碱基C,其可能性为0.98。除含有CAAT-Box、TATA-Box等基本启动子元件外,还存在众多参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、水杨酸响应元件等应答激素和胁迫信号元件,表明PG基因的转录和表达可能受到激素、干旱、光照等外界环境的胁迫以及衰老的调控。     

浮萍中一个新rbcS基因启动子的克隆及分析

为了分离组织特异性、诱导性的启动子,本研究根据新克隆的浮萍rbcS基因序列设计引物,采用改进的5'walking技术从浮萍基因组中克隆了一个新的rbcS基因启动子,命名为SSU5C基因启动子。序列分析表明:SSU5C基因启动子长度为1543bp,含有保守性元件TATA和CAATbox,并且含有水杨酸、脱落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯等植物激素和葡萄糖等的保守顺式作用元件。Insilico分析初步推测SSU5C基因启动子受多种信号途径的协调调控。     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

海岛棉GbCHI基因启动子的克隆及瞬时活性表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是类黄酮代谢途径中关键的限速酶之一,与植物的花色形成、抗虫、抗病等特性密切相关。本研究利用前期转录组测序及差异基因表达分析,筛选到与海岛棉抗枯萎病相关基因GbCHI,并从海岛棉抗病品种‘06-146’基因组中克隆了该基因的启动子,序列长度为2 062 bp。启动子分析软件Plant CARE预测GbCHI基因启动子序列除了含有启动子基本元件TATA-box和CAAT-box外,还包括与光照、激素、真菌诱导响应及参与黄酮类生物合成基因调控的MYB转录因子结合位点等顺式作用元件。通过瞬时转化烟草叶片的表达分析进一步表明:在MeJA、SA和枯萎病诱导下该启动子具有驱动GUS基因表达的特性。本研究结果可为后期开展GbCHI基因参与海岛棉抗枯萎病的调控机制研究奠定良好的理论基础。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14启动子克隆与功能分析

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

荔枝GRX基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了研究荔枝GRX基因的调控机理,本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 996 bp的启动子片段并对其功能进行了初步分析,结果表明:荔枝GRX基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats、TGA-element等各种转录调控相关的顺式作用元件。基因枪表达分析表明,该启动子能驱动GUS基因在荔枝的花、叶、根、果皮以及果核中表达而在果肉中不表达,具有组织特异性。为进一步研究荔枝GRX基因的表达模式和调控机理提供了基础与依据。