棉花抗枯萎病相关基因GhWRKY48的克隆及表达分析

棉花枯萎病是影响棉花产量和品质的最重要病害,WRKY转录因子在植物抗病中扮演重要角色。本实验以高抗枯萎病的陆地棉‘中棉所12’为实验材料,以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针,从陆地棉‘中棉所12’根部c DNA中克隆WRKY转录因子基因。通过多序列比对分析发现该基因属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族,将该基因命名为GhWRKY48。GhWRKY48基因的序列分析发现,cDNA全长为1 074个核苷酸,编码了357个氨基酸,蛋白分子量为3.94 kD,脂肪指数为56.86,等电点6.20,含有1个WRKY结构域及1个C2H2型锌指属于疏水蛋白。基因的蛋白二级结构包括延伸链、α螺旋和无规则卷曲。通过RT-qPCR的结果发现,枯萎病菌处理后,GhWRKY48的基因表达量显著低于对照组,预测该基因可能参与棉花抗枯萎病反应体系。本研究结果为棉花抗枯萎病提供一定的研究思路与途径。     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

通过GbF3'H基因单独沉默及其与GbCHI和Gb DFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3'H基因及共沉默GbF3'H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3'H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3'H基因单独沉默以及GbF3'H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3'H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3'H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型空载体对照GbF3'H单基因沉默组3种基因共沉默组,说明共沉默材料对枯萎病的抗性明显低于单基因沉默材料,单基因沉默材料明显低于空载体对照和野生型。【结论 】初步确定GbF3'H基因对提高海岛棉枯萎病抗性有一定作用,且可与Gb CHI、GbDFR基因协同作用增强抗病性,这可为海岛棉功能基因组学研究提供参考。     

海岛棉枯萎病抗性与糖基转移酶类基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一，研究枯萎病抗性分子机制是培育抗病海岛棉品种的分子基础。基于对前期转录组测序数据分析，本研究对参与海岛棉抗枯萎病调控的糖基转移酶基因进行了初步研究，以8个不同抗病性的海岛棉品种为材料，在枯萎病菌处理后，利用实时荧光定量PCR检测9个棉花抗枯萎病相关基因进行表达量分析，结果表明，GB＿A03G0575在海岛棉枯萎病侵染过程中随着时间的推移，表达量会先减少再增加，推断其可能在受到病菌胁迫时植物生长会受到影响。GB＿A13G1825和GB＿A11G1787基因在抗病材料中的表达量会比感病材料的多，最大表达量出现的时间，感、抗材料基本一致，推测这些基因对抗病有一定影响，表明在抗病过程中三个基因可能起着比较重要的作用。本研究结果为海岛棉抗枯萎病育种及抗病机理提供候选基因资源。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。     

刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

木薯EIL基因克隆和蛋白诱导表达及纯化

ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE(EIL)基因家族是乙烯信号通道重要的正调控因子,在乙烯信号传递过程中启动抗病相关基因表达参与植物免疫应答提高植物的抗性。为了研究EIL基因编码蛋白与下游靶基因特异性结合传递乙烯信号,是否参与木薯抗逆境胁迫的调控,本研究从木薯中克隆一个EIL同源基因,命名为MeEIL。分析MeEIL启动子所包含的各种功能元件,结果显示该启动子中含有G-box、W box和MYC等元件。对MeEIL基因的ORF分析结果表明该基因编码含621个氨基酸残基的蛋白质。使用同源重组的方法将MeEIL的CDS序列连接到蛋白表达载体pET32a上。SDS-PAGE检测表明在28℃和16℃都可成功诱导蛋白表达,且28℃诱导效果更佳,通过大量诱导蛋白表达并用His标签纯化试剂盒纯化,Western blot分析验证MeEIL蛋白被成功的诱导出来。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。     

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢相关基因表达量的相关

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一, 研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上, 对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(DEG, Differentially Expressed Gene); 以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料, 利用qRT-PCR的方法研究抗病差异表达基因在不同接菌时间点的表达量差异, 并分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明, DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点, 类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料, 其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述, 类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响, 且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

新疆野扁桃CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析

CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽,对增强植物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因家族成员Als CBF翻译起始位点上游的启动子序列,长度为1 391 bp(Gen Bank登录号:KP662710)。对启动子序列进行生物信息学分析表明,该序列存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,并且含有多个与植物非生物胁迫有关的响应元件:ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和LTRE低温应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明,该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告GUS基因表达的功能。本研究可为揭示CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理,以及为增强野扁桃CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础,同时对野扁桃的繁育和保护也有极为重要的意义。     

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢途径基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一,研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上,对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(Differentially Expressed Gene,DEG);以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料,利用qRT-PCR方法研究抗病差异表达基因在接种0~40 h的表达量差异,分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明,DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点,类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料,其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述,类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响,且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的研究进展

转录因子是一类调节基因表达的重要调控蛋白,转录因子和与其结合的启动子中的相关顺式作用元件,在基因表达方面起着分子开关的作用,因此探究转录因子与启动子的相互作用尤为重要。为了研究在植物遭受逆境胁迫时,转录因子对下游靶基因的调控机制,本文综述了参与逆境胁迫的主要转录因子家族、转录因子的转录激活活性鉴定、转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的应用,为全面、深入研究植物应答逆境胁迫时的基因表达调控机制提供参考。     

甘蔗ShSAP1基因启动子的克隆与序列分析

启动子在转基因育种中具有重要地位,为了发掘高效的胁迫诱导和组织特异型启动子,提高目的基因的表达效率,根据甘蔗逆境相关蛋白家族基因ShSAP1的基因组序列,利用Genome Walking法对ShSAP1的启动子进行了分离,并对其序列进行了生物信息学分析。分离获得了1243 bp的启动子序列,该序列具有启动子的核心元件,还包含了干旱等胁迫相关的应答元件、MYB/MYC转录因子识别与结合元件、光应答元件及组织特异性相关元件,说明ShSAP1的启动子可能具有逆境应答及组织特异表达特性,值得开展进一步的功能研究。     

菊芋果聚糖合成酶基因1-FFT启动子克隆与功能分析

本研究通过Tail-PCR方法分离到菊芋1-FFT基因上游长度为1 611 bp的片段(FFTP)。神经网络启动子在FFTP序列中预测到8个启动子核心结构,瞬时表达结果显示起始密码子上游400 bp的启动子核心结构域与1 611 bp的启动GUS基因表达的活性无明显差异,表明-296到-246区域就是1-FFT基因的启动子区域。PlantCARE分析表明,FFTP序列中除基本启动子元件(TATA-box和CAAT-box)外,还含有与MYB转录因子结合的元件3个,参与光调控的顺式作用元件12个,茉莉酸反应、厌氧过程、脱落酸、抗逆反应的元件各2个,昼夜节律控制、生长素和赤霉素反应的元件各1个。这些顺式作用元件的鉴定为1-FFT参与相应的生物学过程提供理论依据。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。