花生田施用绿僵菌对土壤微生物群落的影响

昆虫病原真菌绿僵菌对地下害虫防治具有良好应用前景，而大量释放绿僵菌可能引起土著微生物群落变化，从而影响其植物保护的综合效果。本文研究了花生播种期施用绿僵菌后，在根际和根围土壤中绿僵菌自身种群及土著细菌、真菌和放线菌种群的消长和群落结构变化。结果表明，绿僵菌种群在30 d内快速下降，之后降速减缓，以低密度持续存活。随花生生长，土壤微生物自身有消长过程，施用绿僵菌对放线菌影响最大、真菌其次、细菌最小，在根际的影响大于在根围的影响。分别地，绿僵菌处理对根际和根围细菌、根围真菌无显著影响；使根际真菌种群初期的下降速度减缓，到达谷底时间由15 d推迟到30 d，但回升速度加快，达峰顶由60 d提前到45 d，峰值降低1/3；绿僵菌明显抑制了根际放线菌种群，使其消长变化周期与对照完全相反，且45 d时回落至低点后不再回升；绿僵菌减缓了根围放线菌种群下降，使达谷底时间由30 d推迟到45 d，且回升幅度减小。土壤微生物群落结构在施菌后15～30 d的幼苗至初花期有明显变化，细菌种群总体占比显著下降，但与对照相比，施菌后的根际细菌占比提高，真菌占比下降，放线菌占比显著地先抑后扬。在根围的变化相对较小。45 d即盛花期后，三类微生物结构逐渐恢复趋近原来状态。     

金龟子绿僵菌在草原羊草和克氏针茅根际的种群动态和根内宿存鉴定

绿僵菌防治草原蝗虫效果显著,其在草原田间的存活能力影响其持续控害效果。除了侵染昆虫,绿僵菌还具有在植物根际宿存和根内生的生活方式,但相关宿存规律和内生性的研究报道很少。本文研究了绿僵菌在内蒙古草原两种优势种植物羊草和克氏针茅根际的种群数量变化并对其在这两种草的根内宿存进行了鉴定。结果表明,在干旱的内蒙古草原,绿僵菌施用后种群数量在30 d内快速下降,但能够以低密度在羊草、克氏针茅根际土壤中至少延续宿存75 d,羊草根际环境比较利于绿僵菌生存。对菌株egfp基因标记的特异PCR检测证明了绿僵菌在羊草和克氏针茅根内宿存。试验数据为指导植保生物防治中充分利用绿僵菌的昆虫病原性和植物内生特性提供理论基础,也将成为绿僵菌物种生活方式多样性、与植物互作及共进化研究的重要基础。     

金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响

丝状真菌的fluG基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中fluG的作用鲜有研究报道。本研究利用DNA同源重组方法,构建敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因ben作为筛选标记,fluG基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用PEG介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG突变株继代培养5代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明fluG基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。     

绿僵菌黏附素MAD1体外表达及诱导花生响应的作用

【目的】绿僵菌具有昆虫致病性和植物共生性,其黏附素MAD1在绿僵菌侵染寄主昆虫过程中起重要作用。通过体外真核表达MAD1蛋白,明确MAD1在绿僵菌与植物共生中发挥的作用。【方法】以绿僵菌转录组的Unigenes作为参考序列,在GenBank中进行同源性检索比对,设计引物,以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）IPPM010202菌株的cDNA作为模板,克隆得到mad1,通过DNAMAN对mad1序列进行蛋白翻译,利用ProtParam在线工具预测MAD1蛋白氨基酸组成及其理化特性,利用SMART在线程序分析其结构域。构建mad1重组真核表达载体并转化毕赤酵母,获得重组子,通过甲醇诱导表达得到MAD1蛋白;通过Ni-NTA亲和层析获得纯化蛋白。以纯化蛋白溶液（20 μg·mL^-1）浸没处理花生根0.5、6、12和24 h,通过qPCR检测花生根膜受体基因（CERK1、RPK）、免疫相关级联基因（MAPK、MMK1、CDPK）和转录因子基因（MYB86）、细胞壁整合基因（SCW1）及防御相关基因（PTi1、RML1A）的转录水平。【结果】克隆得到了绿僵菌黏附素基因mad1,全长2 136 bp,编码711个氨基酸,分子量约为74.8 kD;生物信息学分析表明,MAD1的N端有信号肽,C端有糖基磷脂酰肌醇（GPI）细胞壁锚定位点,且含有CFEM功能结构域,属于亲水性蛋白。成功构建了MAD1真核表达系统,诱导表达并纯化出具有生物活性的MAD1蛋白,对花生根进行不同时间段的处理,发现MAD1处理后0.5 h,根尖细胞感知并启动膜类识别受体基因CERK1表达;0.5—6 h,根膜受体基因CERK1、RPK转录水平均上调,膜整合基因SCW1转录由下调转为上调,免疫反应相关基因MAPK、MMK1、CDPK、MYB86的转录受到短暂抑制,防御基因PTi1、RML1A转录下调,植物根部免疫防御反应受到抑制;6—12 h,膜受体基因维持上调表达,而防御基因RML1A从下调逆转为强烈上调;12—24 h,膜受体类基因CERK1、RPK,防御基因PTi1、RML1A均上调,免疫相关级联基因MAPK、MMK1、CDPK,转录因子基因MYB86也出现微弱的上调,植物根部启动免疫防御反应。【结论】在绿僵菌与花生根的互作早期,绿僵菌MAD1蛋白 6 h时已激活花生根膜受体基因CERK1和RPK的识别响应,同时抑制花生免疫级联基因MAPK、CDPK、MMK1及防御相关基因如PTi1、RML1A的表达,有助于绿僵菌在花生根组织上定殖;随后诱导花生细胞壁整合基因SCW1上调表达,参与根上受损细胞壁的修复与重建,促进绿僵菌与花生共生关系的建立。诱导植物的免疫抑制和细胞壁重建整合可能是绿僵菌与植物建立共生关系的重要步骤。     

绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）mad2敲除突变株（Δmad2）,探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除盒S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株。通过对比敲除株与野生株（WT）的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12 h和14 h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8%和76.3%;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。敲除株处理花生12 h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因（CaM、CCaMK和DELLA）、脂质氮素转运相关基因（LTP1、NRT24、ABCC2）的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NRT24的转录无明显影响。【结论】金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录。     

金龟子绿僵菌黏附素基因mad1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT50为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC1、PCD4,抗病基因SWEET10及转录因子WRKY41、MYB86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML5、CML19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些作用有助于金龟子绿僵菌在花生根组织上定殖。     

绿僵菌与植物的多重关系及其在植物保护中的应用潜力

绿僵菌是广为知晓的昆虫病原真菌,被用作生物杀虫剂防治多种农林植物害虫。近年发现它也是根际微生物群落的一员,且有证据表明它内生于一些植物的根组织中,具有促进植物生长、拮抗植物病原菌、诱导植物抗性等作用。本文着重综述绿僵菌根际作用和植物内生性研究进展,从对植物的直接作用角度,了解其田间生态适应性及与植物的互作关系,以拓展昆虫病原真菌作为植物保护剂的认识,有助于根据生态学特点制定未来的生物防治应用策略。     

真菌防治蝗虫研究进展

蝗虫是世界性重大成灾害虫,时常在草原、沙漠区或农作区暴发为害。当前的非洲沙漠蝗灾害再次提醒人们,蝗灾依然是粮食生产和生态安全的严重威胁。在寻求绿色可持续防蝗的新策略新技术研究中,昆虫病原真菌显现出种类多、毒力强、易规模化生产及环境友好等明显优势而倍受重视。近30年,真菌防蝗研究和应用进步加快,国际、国内都有真菌防蝗产品的注册登记和大规模应用。本文综述了真菌杀虫机理、防蝗菌株选育、规模化生产及应用进展,分析了存在的问题,提出了在蝗虫幼龄期施菌干预种群发展的建议,展望了未来发展前景,为蝗灾绿色防控提供参考。     

金龟子绿僵菌对苜蓿生长的影响及对苜蓿抗蚜性的诱导作用

为明确金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae在促进植物生长和提高植物抗性方面的作用,以金龟子绿僵菌拌土种植紫花苜蓿Medicago sativa,于室内测定植株的生长参数、苜蓿斑蚜Therioaphis trifolii的取食选择性及其发育历期和繁殖力。结果表明,金龟子绿僵菌处理后7 d,植株株高比对照显著增加了0.87 cm;处理后14 d,植株分枝数为3.88个,根长为54.67 mm,均显著高于对照。株龄14 d的植株接入苜蓿斑蚜,至株龄28 d时,金龟子绿僵菌处理的植株株高、分枝数和根长均较对照显著增加;同时生物量、叶绿素含量和类胡萝卜素含量也有不同程度的升高。选择性试验结果显示,24 h内选择并驻留在金龟子绿僵菌处理植株叶片上的苜蓿斑蚜数量较对照显著减少28.57%。以金龟子绿僵菌处理的植株叶片饲喂苜蓿斑蚜,1～4龄若虫的发育均有所减缓,各龄若虫的发育历期均较对照叶片饲喂的各龄若虫有所延长,而成虫寿命较以对照叶片饲喂时显著缩短了30.09%,总生命历期显著缩短了18.83%。表明金龟子绿僵菌促进了紫花苜蓿植株的生长,同时增强了植株对苜蓿斑蚜的耐害性、排趋性与...