家蚕Ring基因的克隆及序列特征与组织表达分析

Polycomb group(PcG)蛋白是多细胞有机体中的一类表观遗传抑制因子,Ring是Pc G蛋白家族的主要成员,在Pc G蛋白的转录抑制调控中行使重要功能,对昆虫和哺乳动物的发育至关重要。利用同源检索方法获得家蚕Ring基因(BmRing)的核苷酸序列,该基因位于家蚕第17号染色体的nscaf2865位点。BmRing的核苷酸序列由4个外显子和3个内含子构成,基因的c DNA3'端有2个多聚腺苷酸化信号(aataaa)和典型的poly(A)结构;BmRing编码由377个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为41.8 k D,等电点为6.72,氨基酸序列具有3个同源异型结构域(homeobox domain,HD),46~85 aa为高度保守的典型的环指结构域(Ring finger),331~347 aa为跨膜区,N端位于膜外。通过STRING在线预测分析得到10个与BmRing有相互作用关系的蛋白质。系统进化分析显示BmRing与果蝇的Dm SCE、意大利蜜蜂的AmRing等的亲缘关系较近。以家蚕5龄第3天幼虫的卵巢c DNA为模板,克隆了BmRing基因,并利用半定量RT-PCR检测BmRing基因在5龄第3天幼虫的精巢、卵巢、头部和血细胞中有明显表达,而在其他组织中几乎不表达。获得的上述基础信息,有益于进一步研究BmRing的生物学功能。     

家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。     

家蚕模式识别受体βGRP4的序列分析及诱导表达

β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)属于模式识别受体(PRR),很多无脊椎动物的βGRP具有结合β-1,3-葡聚糖的能力,在识别入侵病原物和激活免疫调控途径中起着重要作用。对克隆的家蚕βGRP4(BmβGRP4,GenBank登录号为:GQ372969)及编码蛋白进行序列分析和诱导表达,探讨其参与免疫应答的作用方式。BmβGRP4的开放阅读框(ORF)长1 128 bp,编码375个氨基酸,具有一个由17个氨基酸组成的信号肽,预测成熟体蛋白分子质量为40.3 kD,等电点为6.5。BmβGRP4含有一个糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16),具有结合β-1,3-葡聚糖的能力。将BmβGRP4亚克隆到p28载体进行原核表达,获得带有His标签的重组蛋白。给家蚕5龄第3天幼虫分别以1×109个/头的剂量添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导18 h后家蚕体内的BmβGRP4表达水平进行Western blotting分析,结果表明BmβGRP4能被上述3种微生物诱导而产生较强的表达活性。研究结果提示BmβGRP4可能在家蚕先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用。     

家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。     

溴氰菊酯胁迫下家蚕品种辐7解毒酶基因的表达模式

昆虫体内解毒酶的过量表达和活性增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的主要原因。辐射诱变家蚕品种辐7对菊酯类农药具有较强的耐受能力,研究溴氰菊酯胁迫下辐7体内解毒酶基因的表达模式,对于解析辐7的农药耐受性机制,培育耐农药污染的家蚕品种具有重要意义。根据不同浓度溴氰菊酯处理后辐7雄蛾的求偶和交配行为观察,最终选择2.5 mg/L溴氰菊酯处理组进行解毒酶基因的表达检测。采用荧光定量PCR检测溴氰菊酯处理后3 h和6 h辐7雄蛾触角解毒酶基因(8个羧酸酯酶基因、2个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、1个糜蛋白酶基因、3个脂肪酶基因、1个细胞色素P450基因和1个谷胱甘肽-S-转移酶基因)的转录水平：7个羧酸酯酶基因的表达先上调再下调,1个羧酸酯酶基因表达先下调再上调;1个细胞色素P450基因、1个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和1个糜蛋白酶基因表达先上调再下调;1个谷胱甘肽-S-转移酶基因、1个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和2个脂肪酶基因表达持续上调;1个脂肪酶基因表达在处理后6 h上调。结果表明,溴氰菊酯处理后诱导辐7雄蛾体内解毒酶基因转录水平上调,从而在一定程度上增强了辐7雄蛾对微量菊酯类农药的耐受性。     

转录抑制因子RYBP的研究进展

Pc G蛋白(polycomb group proteins)是多细胞有机体中一类重要的表观遗传抑制因子,其功能是维持细胞分化和个体生长发育过程中基因的正确表达。转录抑制因子RYBP(Ring1 and YY1 binding protein)是Pc G蛋白家族成员,可以与Ring1A、YY1和M33等其他Pc G蛋白家族成员相互作用,通过形成蛋白质复合体的形式行使功能。本文简述RYBP基因在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)等模式生物中的表达特征,综述RYBP在基因转录调控、干细胞分化、细胞凋亡和恶性肿瘤发生中的作用及其转录抑制机制,以期较为详细了解RYBP的研究进展,为鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)RYBP的研究提供借鉴。     

家蚕品种野三元耐微量拟除虫菊酯类农药污染新品系的筛选

基于为培育耐农药污染家蚕品种和研究家蚕对农药的耐受性机制提供基础材料的目的,对包括家蚕四元杂交品种野三元中2个含野桑蚕血统的中系亲本野A、野B和2个日系亲本84Y2、784等在内的160份家蚕品种资源,以0.01 mg/L杀灭菊酯添食后进行耐药性筛选,供试家蚕品种中的野B、辐射诱变品种辐7对微量杀灭菊酯具有较强的耐受能力。进一步以0.1～0.3 mg/L杀灭菊酯添食诱导后,自野A、野B中筛选建立了新的耐受性品系野AJ、野BJ,另以辐7为母本,分别以84Y2、784为父本杂交后培育获得新的耐受性品系辐84Y2、辐784。从以上4个新品系中均获得了添食微量杀灭菊酯后幼虫存活率100%的蛾区。4个对微量杀灭菊酯具有较强耐受性的新品系,进一步通过农药诱导选择及系统选择提高和固定其耐受性水平后,可作为耐农药污染新品种的育种材料。     

昆虫先天免疫的肽聚糖识别蛋白的研究进展

先天免疫系统的激活是通过一系列高度保守的模式识别受体识别病原体相关分子模式。肽聚糖识别蛋白家族是重要的模式识别受体,从昆虫到人类均高度保守,可识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌,在先天免疫和获得性免疫应答中发挥重要的识别和调节功能。