伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1 000bp片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,双脱氧末端终止法序列测定.通过OM1GA2.0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30.38 kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上.将α-疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域.将该片段插入原核表达载体pGEX-KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX-UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56 kD.     

特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选

EP0基因是伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PEV）的早期基因，可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siENA序列，本研究按照Ambion公司公布的siENA分子设计原则，设计并合成了3个针对PEVEa株EP0基因的siENA模板EP04、EP08和EP12，分别克隆到以CMV启动子的siENA表达载体pSilencer4．1-CMVneo中，构建相应的重组表达质粒p4．1-EP04、p4．1-EP08和p4．1-EP12。同时，将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中，按照读码框架与EGFP基因的5′端融合，获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4-1EP04、p4-1-EP08、p4-1-EP12和阴性对照质粒p4．1-NK分别与pEP0—EGFP共转染IBES-2细胞，荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT—PCE检测结果表明，三个siENA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达，抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04；在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论。这为深入研究EP0基因在PEV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础。