新型小分子RNA-piRNAs的研究进展

由非编码小分子RNA(siRNAs,miRNAs)诱导的RNA干涉作为基因功能研究、基因治疗等新工具,目前已成为分子生物学的研究热点。最近,一种新型小分子RNA-piRNAs在老鼠的生殖细胞中被发现,特异性地与Miwi蛋白结合,被认为是精子发育及合子形成过程中必不可少的。本文就piRNAs的发现、遗传特性和可能的作用模式作一综述,并阐述了研究意义和应用前景。     

鹌鹑血液中小分子RNA表达的初步研究

利用改进的Trizol法首次从鹌鹑血液中提取小分子RNA,比较小分子RNA在组织与血液中的表达差异,为简化小分子RNA的提取程序,提高实验研究效率以及探讨小分子RNA的遗传特性提供可供借鉴的资料.结果发现:①改进Trizol法提取血液中的总RNA,效果显著,条带清晰;②发现血液中只存在一种小分子miRNAs(18～22bp);③影响小分子RNA提取效率的关键因素包括样本的新鲜程度和RNA酶的污染.研究结果表明,通过改进的Trizol法提取血液中小RNA方法是可行的,小分子KNA在家禽血液中的表达具有特异性,snoRNAs,piRNAs在血液中不表达.     

禽产品安全控制研究进展

在食品安全方面,最重要的发现之一是冷链系统在食品运输中的发展。从那以后,HACCP的采用已经在食品生产业中成为另一项改革,而分子生物学的最新进展使得快速微生物学方法的发展和运用相对于传统的方法来说是一种改革。公众在与食品中细菌传播有关的风险因子方面的知识已得到提高,但对弯曲杆菌的了解仍然很少。在这种情况下,本文将讨论一些细菌诊断工具,细菌收获前后的控制措施和收获后处理方法的优化。     

鸡X期胚盘细胞电转染外源基因条件的探索

以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。     

徐淮山羊PPAR基因克隆及其表达产物亚细胞定位的研究

研究旨在克隆徐淮山羊过氧化物酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白对该基因产物亚细胞水平定位。采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织PPAR基因cDNA,并构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-PPAR,聚乙烯亚胺(PEI)介导基因转染NIH-3T3细胞,48h后荧光倒置显微镜下观察基因表达产物的分布,RT-PCR检测mRNA在体外水平的表达。结果表明:首次成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的全序列cDNA,大小为1428bp,GenBank登录号为GU082382;构建了融合表达载体pEGFP-C1-PPAR;RT-PCR检测mRNA表达明显;EGFP-PPAR融合蛋白定位在NIT-3T3细胞质中。体外克隆的徐淮山羊PPAR基因cDNA,在单细胞水平上可表达于细胞质中,结果为进一步研究PPAR的生物学功能奠定基础。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

徐淮山羊LPL基因克隆及其表达产物亚细胞定位的研究

旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位.本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-LPL.聚乙烯亚胺(PEI)介导pEGFP-C1-LPL转染NIH-3T3细胞,48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并用RT-PCR方法检测LPL mRNA在细胞内的表达.结果,成功克隆出山羊LPL基因1 530 bp长的cDNA,完整阅读框大小为1437 bp,共编码478个氨基酸,GenBank登录号为GU082383.信号肽区域预测结果表明LPL蛋白含有一小段信号肽序列,其可能性为100%.信号肽酶切割位置在第23和24个氨基酸之间,其可能性达到65.9%.成功构建融合表达载体pEGFP-C1-LPL,并且RT-PCR显示转染后LPL在mRNA水平上表达明显.EGFP-LPL融合蛋白定位在NIT-3T3细胞外和细胞膜部分.结果表明,首次成功克隆出徐淮山羊LPL基因cDNA;重组质粒pEGFP-C1-LPL构建成功,并在NIH-3T3细胞中明显表达.     

徐淮山羊PPAR基因cDNA的克隆和生物信息学分析

为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能.根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNAStar软件及在线工具进行生物信息学分析.成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的编码区全序列cDNA,大小为1 428 bp,GenBank登录号为GU082382,有起始密码子ATG和终止密码子TAG,编码475个氨基酸;徐淮山羊PPAR基因序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊相应编码区(CDs)的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%,徐淮山羊PPAR氨基酸序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊的PPAR氨基酸序列同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%;PPAR蛋白无信号肽区域,属于非分泌型蛋白.     

鹌鹑早期原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究

本研究旨在观察鹌鹑早期原始生殖细胞的迁移和聚集规律,为分离PGCs,并将其应用于转基因技术提供依据。运用QH1单抗标记特异性的识别鹌鹑的PGCs,检测早期各个阶段PGCs的分布和数量。研究表明:鹌鹑的原始生殖细胞(PGCs)起源于胚盘暗区,而后逐渐迁移至明区、生殖新月区。孵化27h,已有少量PGCs分布于明区的血管中。到孵化36h时,有大量的PGCs聚集在明区血管网中,左右两侧都有。孵化45h时,从头部到脐肠系膜PGCs均有散在和聚团分布,并主要聚集在头部间充质的血管中。PGCs在各个时期的数量存在差异,有2个增殖高峰期,即原条期(孵化6h)和十体节期(孵化36h)。QH1单抗可鉴定早至未孵化期的鹌鹑原始生殖细胞,PGCs在早期胚盘中是随机散在分布的,而且具有2个增殖高峰期。     

地方鸡种小分子RNA在性腺中表达形式的初步研究

选用12周龄的文昌鸡12只(8♂4♀)、如皋鸡10只(3♂7♀)、安卡鸡8只(4♂4♀),分别采集睾丸和卵巢,提取小分子RNA后,统计在16~25 bp,26~45 bp,60~200 bp这3个片段区间里小分子RNA的条带数目并计算各自的频率,初步研究小分子RNA在地方鸡种性腺中的表达形式。结果发现:(1)miRNA在不同鸡种的卵巢和睾丸中均未检测到,piRNA的分布较少,snoRNA的含量最高;(2)piRNA和snoRNA在3种鸡的卵巢和睾丸之间分布都没有显著性差异(P>0.05);(3)在睾丸组织中,piRNA和snoRNA在如皋鸡和安卡鸡之间差异显著(P<0.05);(4)在卵巢和睾丸之间,piRNA和snoRNA表达分布趋势表现一致,但在不同品种之间存在一定的差异。这一结果为探讨小分子RNA的遗传特性及发生和消失的机理提供了基础依据。