猪YTHDF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein,YTHDF2)作为一种m~6A修饰的结合蛋白,可对底物mRNA的剪接,翻译,降解等过程进行调控。本研究通过RT-PCR首次获得了猪YTHDF2编码基因序列,全长1 743 bp,编码580个氨基酸,基因进化树分析显示该基因在各物种间保守性较高。将猪YTHDF2编码基因克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,重组质粒pET-28a (+)-YTHDF2在大肠杆菌BL-21菌株中进行原核表达,成功获得了大量带His标签的猪YTHDH2重组蛋白,大小约70 kD。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备猪YTHDF2多抗血清,ELISA结果表明制备的兔抗猪YTHDF2多抗血清效价为1:204 800,间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验均表明该多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。猪YTHDF2基因序列的获得及多克隆抗体的制备为进一步研究YTHDF2在猪mRNA m~6A甲基化过程中的生物学功能奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒ns7、ns7a蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为获得免疫原性好的猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)辅助蛋白ns7和ns7a,并制备特异性的多克隆抗体,以用于ns7和ns7a蛋白功能的初步研究,本试验构建原核表达载体pGEX-PDCoV-ns7和pGEX-PDCoV-ns7a,测序正确后转入E.coli BL21(DE3)中诱导表达。利用GST-Resin进行蛋白纯化,将获得的重组蛋白以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠,成功制备4份PDCoV ns7和2份ns7a小鼠多克隆抗体,并用ELISA、Western blot和IFA对抗体效价、反应性及特异性进行鉴定。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了可溶性ns7和ns7a蛋白,制备的PDCoV ns7和ns7a多克隆抗体效价分别为1∶409 600和1∶12 800,并在Western blot和IFA试验中具有良好的反应性及特异性。结果表明,制备的PDCoV辅助蛋白ns7和ns7a多克隆抗体为深入研究ns7及ns7a蛋白的生物学功能提供了重要工具。