胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

牛的3种单个早期胚胎中基因表达的差异

为建立哺乳动物单个早期胚胎中基因表达的分析方法,解决胚胎实验中取材困难的矛盾,本研究以牛体内受精胚(in vivo cultured,IVC)、体外受精(in vitro fertilization,IVF)和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)3种来源的7日龄囊胚作实验材料,通过单个胚胎直接裂解后进行逆转录结合随机引物指数扩增的方法富集相应cDNA.对克隆囊胚cDNA库中随机挑选的15个阳性克隆进行测序和EST分析.并运用特异性的引物,对哺乳动物胚胎发育的3个重要基因Nanog,Oct-4和Sox2的表达进行了扩增和表达检测.结果表明,在哺乳动物胚胎囊胚阶段,这3个维持细胞多能性的相关基因的表达都相当活跃;相对于体内胚和体外受精胚,克隆胚中这3种基因的表达明显偏低.本方法为牛植入前胚胎发育阶段特异性基因的筛选和基因表达模式的研究提供了有效的材料和技术途径.     

三种培养基对牛体外受精胚胎发育的影响

本文比较了三种培养基：（1）B2（LABORNI、OIREC．C．D,France）＋颗粒细胞（GC）、（2）IVMD-101（FHK,Japan）、（3）ACM（本实验室自配）＋胎鼠成纤维细胞（MEF）,对牛体外受精胚胎发育的影响。结果显示,以卵裂率（％）来说,第1,2组和第3组分别为65．3±0．05、73．8±0．12及72．7±0．12;以囊胚率（％）来说,第1,2组和第3组分别为33．8±0．05、10．5±0．07及38．9±0．18;而以AB级囊胚率（％）来说,第1,2组和第3组分别为67．6±0．05、60．1±0．04及71．8±0．11。因此,通过统计分析,在我们所研究的三种培养基中,ACM＋MEF效果最好。     

共培养体系中滋养层细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

利用活体取卵(OPU)所得的卵母细胞与牛耳成纤维细胞构建牛体细胞核移植重构胚,并将所得的重构胚进行ACM(培养液)与不同滋养层细胞的共培养,分析不同滋养层细胞类型、传代次数、冻融处理对核移植胚胎体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养中滋养层细胞的合适条件。结果表明:胎鼠成纤维细胞(MEF)培养组的囊胚率和胚胎细胞数(38.2%和135±2.1)显著高于牛颗粒细胞(GC)组(9.1%和101±4.6,P<0.05)和牛耳成纤维细胞(BAF)组(25.9%和115±3.1,P<0.05)。2～4代MEF细胞与胚胎共培养的效果(38.2%和135±2.1)明显好于原代MEF细胞(24.7%和108±3.1,P<0.05)或5～8代MEF细胞(22.8%和102±2.8,P<0.05),新鲜的MEF细胞比冻融处理后的MEF细胞培养效果好(38.2%vs.27.7%,135±2.1vs.110±1.7,P<0.05)。因此,用新鲜的2～4代MEF细胞作为共培养体系中的滋养层细胞有利于牛核移植胚胎的早期发育。     

体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。     

不同亚种牛卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析

在体细胞核移植(克隆)试验中,作为受体细胞的卵母细胞是制约克隆效率的重要因素之一.本文通过对鲁西黄牛和荷斯坦奶牛进行活体取卵(OPU)试验,并以两个不同亚种的卵母细胞分别作为受体细胞进行奶牛体细胞克隆和胚胎移植试验,经卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析,探讨以鲁西黄牛代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体的可行性.结果显示,夏季鲁西黄牛OPU的效果更好,用鲁西黄牛卵母细胞构建的重构胚的融合率显著高于荷斯坦奶牛;鲁西黄牛卵母细胞形成的克隆胚移植后,其妊娠率、产犊率和活产率与荷斯坦奶牛相当;采用不同亚种克隆胚和不同类型受体牛互相组合进行胚胎移植,结果表明亚种内移植组妊娠率明显高于亚种间移植组,而且亚种内移植组非妊娠牛的返情时间也明显推后.以上结果说明,鲁西黄牛可以代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体和胚胎移植受体牛;不同亚种受体牛与克隆胚的适当组合可以显著提高胚胎移植的效果.本研究为以后开展不同亚种间克隆提供了可行性参考.     

青年奶牛活体取卵技术的研究

本文利用B超活体取卵技术(ovumpickup,OPU)对青年荷斯坦奶牛活体取卵,探讨影响活体取卵的因素及对青年奶牛发情周期的影响。4头青年荷斯坦奶牛在连续观察两个发情周期后,进行连续的一周一次OPU操作,持续16周,然后观察OPU后的发情周期特征及卵巢状况。结果显示:在数量上,个体间穿刺卵泡的总数和回收卵母细胞的总数不完全一致,但卵泡直径的百分比构成个体之间无显著差异(P>0.05),回收率相似;在质量上,各级卵母细胞的构成在各个体间没有显著差异(P>0.05);OPU期间奶牛出现情期延长的趋势,且发情表现减弱,但停止OPU后发情基本正常。研究表明:利用活体取卵技术对青年荷斯坦奶牛进行每周一次的长期连续取卵,在一定的条件下,能够达到较为稳定的回收率和获得一定数量和质量的卵母细胞,但会导致奶牛发情周期的改变,而在停止OPU后能较快恢复。     

影响牛活体取卵(OPU)的因素

在B超扫描监视下进行牛的活体取卵（OPU）,根据获得卵母细胞的数量、质量和试验牛的繁殖力对OPU的效果进行评估,并分析影响OPU效率的因素。结果表明,OPU的效率受季节、品种（鲁西黄牛和荷斯坦奶牛）、个体差异和吸卵压力的影响。但是重复每周进行1次OPU操作,对获得卵母细胞的数量、质量和试验牛的繁殖力并无影响。因此,OPU技术可为体外生殖的研究和高质量胚胎的生产提供充足而理想的卵母细胞的一种有效途径。     

家蠶蜕皮和变态的内分泌调节(预报)

1.四龄蛻皮的头部腺体分泌临界期位于正常龄期經过时間50％的时刻;前胸部腺体的分泌临界期則于62%的时期。蛹化蛻皮的头部腺体分泌临界期位于正常龄期經过时間50%的时刻;前胸部腺体的分泌临界期則于營茧开始以后12小时。 2.調节蛻皮變态的各內分泌腺体之间的关系以及它們对蛻皮變态的作用都是通过体液的。 3.四龄飢餓就眠的进食阈值,以及五龄飢饿熱蚕的进食阈值,分别与該龄头部腺体分泌临界期完全吻合。本试驗材料少。試驗结果还必須用更多的品种和數量进一步檢驗。这个报告不过是預备試驗的总結罢了。从討論中,我們想到有幾个問題特別值得探討:①咽側体的分泌临界期以及它对前胸腺的調节作用。②蛻皮素与組織分化的关系。③进食对大脑分泌的影响。