基于1H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析

【目的】应用¹H谱核磁共振（¹H NMR）技术筛选乳热奶牛血清内差异表现的小分子代谢物,从小分子水平和物质、能量代谢的角度探究奶牛发生乳热时其体内的代谢变化。【方法】选取年龄、胎次、体况和泌乳量相近的分娩当天的荷斯坦高产奶牛共32头,根据其血清中钙离子浓度及其有无临床症状分为两组。其中,24头奶牛为健康对照组（Group1, 血钙浓度 > 2.5 mmol·L^-1,无其他任何症状）和8头乳热组（Group2, 血钙浓度 < 1.4 mmol·L^-1,伴有明显乳热临床症状）。32头奶牛分别于清晨饲喂和榨乳前从颈静脉采集血液10 mL,置于离心管中,4℃下以1 500 × g 离心20 min,将离心得到的血清装入1.5 mL的EP管中,置于-80℃下待测。待样品解冻后,分别从每个EP管中抽取400 μL血清,加入200 μL缓冲盐溶液,充分混合、离心后,提取550 μL上清液置于5 mm核磁管中,在500 MHz的核磁共振波谱仪下采集信号。然后利用Topspin和MestReNova等软件将采集到的信号进行傅里叶转换,同时进行调零、校正基线和相位等预处理,去除水峰和尿素峰信号,将一维图谱进行积分分段,并将图谱信息转换为TXT格式文件,以便于后续数据分析,然后使用Chenomx软件进行化合物指认。最后应用SIMCA-P软件对得到的图谱数据进行多元统计分析,包括主成分分析（PCA）和正交修正-偏最小二乘法-判别分析（OSC-PLS-DA）, 同时结合SPSS软件对核磁数据进行单因素方差分析得到的P值以及Loading图,最终筛选出表现差异的小分子代谢物。【结果】本试验成功得到了乳热组和健康对照组奶牛的血清代谢图谱及差异表达代谢物的Loading图;PCA结果显示每组样品均在95%置信区间内,无需剔除,主成分贡献率较低,其中PC1=26.2%,PC2=16.7%,组间差异变量不能被选择;OSC-PLS- DA结果显示经过5次正交信号修正,与分组无关的变量被去除,组间差异达到最大化;与健康对照组相比,共筛选出9种血清差异表达代谢物,其中4种表达上调,分别为 β-羟基丁酸、丙酮、丙酮酸和赖氨酸,5种表达下调,分别为葡萄糖、丙氨酸、丙三醇（甘油）、磷酸肌酸和氨基丁酸;9种差异代谢产物多为糖和氨基酸,相互之间形成了一个能量转化网络图,通过多种代谢途径参与了机体能量代谢过程,其中较为特殊的差异代谢产物,如磷酸肌酸可直接为机体提供能量,其表现降低可能与病牛肌无力和瘫痪有关。此外,本试验中乳热组奶牛氨基丁酸降低,临床表现为精神沉郁、甚至昏迷,这与人类抑郁症患者的氨基丁酸表现相吻合,有关氨基丁酸下降与奶牛乳热精神的关系有待研究者进一步证实。【结论】¹H NMR技术能够被应用于筛选奶牛血清表现差异的小分子代谢物,代谢物差异显著;本试验中乳热奶牛血清差异代谢产物表现出能量负平衡及脂肪动员的病理学特征,提示乳热与能量代谢障碍有关。     

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。     

围产期酮病奶牛高糖现象的研究

在黑龙江省某集约化奶牛场随机选取产后14、21 d的69头奶牛,旨在调查产后酮病奶牛的高血糖现象。根据血浆β一羟丁酸(BHBA)浓度,将试验牛分成酮病组(K)和健康对照组(C)。在酮病组中将产后14d和21 d都发病的分为病程长组(LTK),否则分为病程短组(STK)。检测所有试验牛血浆中GLU,游离性脂肪酸(NEFA)、BHBA和肝功指标。结果显示,围产期高血糖现象主要集中在STK组中;LTK组BHBA极显著高于STK组和C组。LTK组和STK组NEFA极显著高于C组,而LTK组与STK组之间差异不显著。LTK组GIU显著低于C组和STK组,而STK组与C组之间无显著差异。结论是肝功正常的酮病奶牛病程短,血糖维持正常,具有高糖现象;反之,肝功异常的酮病奶牛病程长,血糖水平低于正常。因此,患病奶牛的病程长短与奶牛血糖的调节能力及肝脏的功能状况密切相关。