转基因与强化褪黑素动物生产

随着现代生物学的不断发展并结合原核胚微注射和体细胞核移植技术,转基因已成为当今动物生物技术研究的热点。国内转基因生物育种重大专项的开展加速了转基因动物与转基因食品的研究进程。如何更好地利用转基因技术解决人类对畜产品的需求问题,是摆在科研人员面前的重大课题。褪黑素是一种主要由动物松果体分泌的吲哚类激素,具有调节睡眠、抗衰老、神经保护、促进细胞生长、调控生殖内分泌等生物学功能。本文对转基因技术的发展与应用、转基因动物、转基因食品生产及安全评价、褪黑素的研究现状进行简要综述,并尝试从转基因角度探讨褪黑素的研究与应用,预测其发展前景。     

白藜芦醇和褪黑素对绵羊胎儿成纤维细胞转染及卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在利用白藜芦醇(Re)和褪黑素(MT)提高绵羊胎儿成纤维细胞电穿孔转染(电转)效率、优化卵母细胞体外成熟体系,以提高转基因动物生产效率。将绵羊胎儿成纤维细胞分为6组:对照组、添加白藜芦醇高、中、低(R^-5、R^-6、R^-7)3种浓度组及白藜芦醇和褪黑素联合添加组(R^-5M^-5、R^-6M^-7),通过电转效率和细胞凋亡情况确定电转体系优化方案;通过对细胞周期、线粒体膜电位及活性氧(ROS)的检测研究其作用机制。将绵羊卵母细胞分为对照组及白藜芦醇和褪黑素(R^-5M^-5、R^-6M^-7)联合添加组,通过绵羊卵母细胞体外成熟后卵丘细胞扩展、第一极体排出及体外受精胚胎的卵裂率检测其对卵母细胞体外成熟的作用。研究结果显示,分离的绵羊胎儿成纤维细胞P3代增殖旺盛,细胞生长曲线呈典型的S型;与对照组相比,所有试验组胎儿成纤维细胞的电转效率均显著提高(P<0.05),R^-5M^-5组电转效率最高;R^-6M^-7组显著降低细胞凋亡率(P<0.05),R^-5、R^-6、R^-5M^-5和R^-6M^-7组均显著促进细胞增殖(P<0.05);R^-6、R^-7、R^-5M^-5和R^-6M^-7组G1期细胞增加,S期细胞相对减少,但差异均不显著(P>0.05);R^-6、R^-7、R^-5M^-5和R^-6M^-7组成纤维细胞内ROS水平均显著降低(P<0.05),R^-6、R^-5M^-5和R^-6M^-7组线粒体膜电位均显著增加(P<0.05);R^-6M^-7组显著促进绵羊卵丘细胞扩展、提高卵母细胞第一极体排出率和体外受精胚胎发育能力(P<0.05)。综上,白藜芦醇和褪黑素可以优化绵羊胎儿成纤维细胞电转体系,提高卵母细胞体外成熟效率,为白藜芦醇和褪黑素在转基因动物生产中的应用提供参考依据。     

组学技术在奶牛乳房炎上应用的相关研究进展

奶牛乳房炎发病率较高、病因复杂,是影响世界奶牛业发展的主要常见疾病之一。由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等病原体引起的临床和隐形乳房炎对动物性食品安全及畜牧业的正常发展构成巨大安全隐患,全球每年因奶牛乳房炎导致的经济损失多达数十亿美元。近年来随着测序技术的不断突破和测序成本的不断降低,生命科学的研究进入了多组学时代,其在畜牧业中的应用也越来越广泛。对奶牛乳房炎来说,传统的组织病理学筛查、体细胞计数、牛乳pH检测、牛乳电导率检测、酶活检验、红外热显影等诊断技术由于其自身的局限性难以充分全面地阐明其发病机理,已不能满足科研人员的需求。组学技术即Omics,主要包括基因组学技术、蛋白质组学技术和代谢组学技术等。通过基因组学研究不仅能从转录层面上揭示奶牛乳房炎复杂性状的表型变异及遗传基础,还能从转录后调控（miRNAs、LncRNAs等）和表观遗传学修饰（DNA甲基化、组蛋白修饰等）层面挖掘出相关的DNA和RNA变化及多分子间的相互作用规律,能够帮助我们更好地了解奶牛乳腺组织对病原体的免疫应答机制,筛选鉴定出乳房炎抗性的信号通路及关键候选基因,从而提高基因组预测或选择的准确性。利用蛋白质组学技术能够对不同环境不同状态的牛乳及乳腺组织的蛋白质种类、表达丰度、蛋白互作、翻译后修饰等进行比较分析,对差异表达的蛋白质经过COG功能注释、数据库比对、GO和Pathway富集分析,可以从蛋白水平揭示乳房炎发生及防御过程中的复杂调控机制,同时还能发现乳房炎诊断的标记分子,进而为乳房炎治疗药物的研发提供潜在的精准靶点。代谢组学是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学研究,能够同时对机体在内、外环境等复杂因素作用下及特定生理时期内所有低分子量代谢产物（如氨基酸、脂类、碳水化合物等）进行精准、高效的定性和定量分析,从而阐明相关的代谢途径;其作为基因表达的最下游,能使基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上得到放大,进而可以更充分地反映细胞功能。将代谢组学技术应用到奶牛乳房炎研究中,能够分析出差异代谢物、鉴定出相关的生物标志物,进而揭示奶牛乳腺的生理及病理变化过程。总之,将各组学技术及多组学整合关联分析应用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御机制,进而为乳房炎的预测、诊断和治疗提供有价值的参考和借鉴。本文就最近几年组学技术在奶牛乳房炎领域的研究进展进行综述,以期为我国奶牛健康及奶业安全发展提供指导。     

外源褪黑素处理方式对荷斯坦奶牛体内褪黑素富集与代谢的影响

为研究正常情况下经产荷斯坦奶牛24 h内血液中褪黑素浓度的变化情况,探索不同外源褪黑素处理方式对荷斯坦奶牛血液褪黑素浓度的影响,本研究采用颈静脉注射、颈部皮下注射、颈部皮下埋植和口腔灌服外源褪黑素等方式处理经产荷斯坦奶牛,观察血液中褪黑素浓度的变化情况并分析褪黑素在体内的分泌规律及代谢速率。结果显示,在24 h内,经产荷斯坦奶牛血液中褪黑素浓度变化明显,04：00浓度最高,为8.30 ng/mL,16：00浓度最低,为2.08 ng/mL。皮下埋植和口腔灌服外源褪黑素以后,血液中褪黑素浓度升高幅度较小;皮下注射46.4、4.64和0.464 mg褪黑素后,血液中褪黑素浓度迅速升高,1 h后达到峰值,分别为561.94、487.03、92.89 ng/mL,极显著高于注射前（P<0.01）;静脉注射46.4、4.64和0.464 mg褪黑素后,血液中褪黑素浓度迅速升高,0.5 h之后达到峰值,分别为767.68、639.19、110.56 ng/mL,极显著高于注射前（P<0.01）,高水平褪黑素可稳定持续48 h。本研究证明了荷斯坦奶牛体内褪黑素分泌有明显的昼夜节律性,静脉或皮下注射外源褪黑素可以迅速提高血液中褪黑素的浓度,且血液中褪黑素的代谢速度与褪黑素的浓度高度相关,随着血液中褪黑素浓度的增加,褪黑素的代谢速度明显加快。     

利用腹腔内窥镜方法比较不同输精时间对羊体内胚胎生产效率的影响

为提高供体绵羊胚胎生产效率,实验选取99只供体母羊,用FSH+CIDR法诱导发情超排。将正常发情的供体母羊随机分成两组进行输精,分别在超排撤栓后的第48 h和54 h利用腹腔内窥镜法输精。其中48 h输精组供体母羊51只,54 h输精组供体母羊48只。其结果显示:撤栓后54 h输精胚胎回收率极显著高于48 h输精组(P0.01);54 h输精组供体卵母细胞受精率(97.27%)极显著高于48 h输精组(87.02%)(P0.01);54 h组供体平均可用胚数显著高于48 h组(P0.05);撤栓后54 h利用腹腔内窥镜输精组可用胚比率(89.70%)显著高于48 h组(80.53%)(P0.05);移植后受体妊娠率,54 h组(70.44%)极显著高于48 h组(56.92%)。本研究结果显示,利用本实验超排方案,供体撤栓后54 h利用内窥镜一次定时输精相对于48 h输精显著提高了供体胚胎生产效率,对羊体内胚胎生产提供理论和技术支持。     

NLRP7基因在母源印记中的研究进展

NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族在先天性免疫系统中行使着重要功能,与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族相类似,该家族十分保守,不仅在植物中存在,也在哺乳动物体内表达。NLRs家族中有许多亚家族,其中,NLRP7(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein7)是NLRP亚家族中的一员,其在多种免疫细胞及免疫器官中表达,可参与细胞生长、增殖和分化过程,在细胞凋亡、炎症反应等生理过程中发挥作用。NLRP7除了在免疫系统中表达外,还在哺乳动物的睾丸、卵巢等生殖系统及早期胚胎中表达,NLRP7的突变通常会导致人类家族复发性葡萄胎疾病的发生,最终导致妊娠失败。近期研究发现,NLRP7是一种母源印记基因,NLRP7异常的印记状态导致了异常的胚胎发育。在猪、牛、羊等大动物中虽然尚未发现葡萄胎疾病,但许多不明原因的流产、死胎等均可能与NLRP7的突变有关。由于进化过程中NLRP7在小鼠等啮齿动物中发生了退化,因此目前有关NLRP7的研究以灵长类为主。作者就近年来NLRP7基因与动物生殖相关的研究进展进行了综述,以期为哺乳动物繁殖障碍等疾病的研究提供参考。     

NLRP7基因在母源印记中的研究进展

NOD样受体（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族在先天性免疫系统中行使着重要功能，与Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族相类似，该家族十分保守，不仅在植物中存在，也在哺乳动物体内表达。NLRs家族中有许多亚家族，其中，NLRP7（NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 7）是NLRP亚家族中的一员，其在多种免疫细胞及免疫器官中表达，可参与细胞生长、增殖和分化过程，在细胞凋亡、炎症反应等生理过程中发挥作用。NLRP7除了在免疫系统中表达外，还在哺乳动物的睾丸、卵巢等生殖系统及早期胚胎中表达，NLRP7的突变通常会导致人类家族复发性葡萄胎疾病的发生，最终导致妊娠失败。近期研究发现，NLRP7是一种母源印记基因，NLRP7异常的印记状态导致了异常的胚胎发育。在猪、牛、羊等大动物中虽然尚未发现葡萄胎疾病，但许多不明原因的流产、死胎等均可能与NLRP7的突变有关。由于进化过程中NLRP7在小鼠等啮齿动物中发生了退化，因此目前有关NLRP7的研究以灵长类为主。作者就近年来NLRP7基因与动物生殖相关的研究进展进行了综述，以期为哺乳动物繁殖障碍等疾病的研究提供参考。     

褪黑素合成酶AANAT/ASMT基因过表达绵羊生物安全评价研究

旨在研究乳腺过表达褪黑素合成酶基因AANAT和ASMT（HIOMT）绵羊的生物安全性,基于本实验室前期建立的乳腺过表达褪黑素合成酶基因AANAT和ASMT（HIOMT）绵羊模型,追踪阳性转基因绵羊的生长性状数据,分析血液及尿液生理生化指标,对肠道微生物、乳中褪黑素水平及乳成分进行检测。结果表明：1）阳性转基因绵羊0、6和12月龄的体重、体长、身高和胸围4项生长指标与普通绵羊均无显著差异（P>0.05）;2）阳性绵羊血液总蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇含量和各类型细胞数量以及尿液中亚硝酸盐、蛋白质和葡萄糖含量等指标均属正常,且与普通绵羊均无显著差异（P>0.05）;3）菌群测序结果表明,阳性绵羊及普通绵羊肠道微生物群落组成及优势菌群均无显著差异（P>0.05）;4）转基因绵羊血液褪黑素表达水平与普通绵羊无显著差异（P>0.05）,夜间褪黑素水平显著高于白天（P<0.05）;乳中褪黑素水平极显著高于普通绵羊（P<0.01）,乳糖含量显著高于对照羊（P<0.05）,体细胞数极显著低于普通绵羊（P<0.01）。综上所述,乳腺过表达AANAT和ASMT（HIOMT）转基因绵羊的生长发育、诸多生理生化指标、肠道微生物菌群等与对照组绵羊相比均无显著差异。此外,转基因绵羊乳中褪黑素和乳糖含量较高,体细胞数含量较低,可能是乳腺中褪黑素发挥抗炎作用,降低了乳中体细胞数。