人XIAP基因多克隆抗体的快速制备方法研究

【目的】探索快速制备高品质X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)多克隆抗体的方法,为研究XIAP基因的功能及XIAP蛋白在肿瘤组织中的表达量检测提供参考。【方法】通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体;考察细胞密度(OD600)、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对XIAP重组蛋白表达量的影响,以确定XIAP重组蛋白的最佳诱导条件,并用Ni-NTA亲和层析柱法纯化XIAP重组蛋白;用纯化的XIAP重组蛋白对2只成年新西兰白兔进行常规免疫后,再对其中1只进行耳静脉注射加强免疫,连续3d,每天免疫1次,用ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】①通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体,测序后,与GenBank中序列的的相似度为97%。②XIAP重组蛋白的最佳诱导条件为:温度30℃,初始诱导细胞密度(OD600)为0.6,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导时间4h。在此条件下,XIAP重组蛋白多以包涵体的形式存在于细胞沉淀中。③利用Ni-NTA亲和层析柱法,在pH为5.9和4.5的洗脱液中均可获得质量浓度为600μg/mL的XIAP重组蛋白。④耳静脉连续加强免疫是刺激动物机体快速产生抗体的有效方法(31d)。ELISA和Western blot检测结果表明,耳静脉连续加强免疫产生的XIAP抗体的效价和特异性均明显高于常规免疫所产生的抗体。【结论】耳静脉连续加强免疫能够显著提高XIAP抗体的效价,且能有效缩短多克隆抗体的制备时间。     

绒山羊次级毛乳头细胞培养优化及miR-206对其调控研究

毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs),对毛囊再生具有诱导能力,并一定程度上决定毛囊的大小,在毛囊周期变化过程中发挥关键作用.本研究旨在优化陕北白绒山羊(Capra hircus)次级DPCs培养液体系,探讨miR-206对次级毛乳头细胞表达模式影响,分析miR-206与次级毛囊周期性发育关系,探索其在陕北白绒山羊皮肤毛囊发生过程中的作用.本研究采集陕北白绒山羊生长期皮肤样本,采用钝性分离与中性蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化相结合的方法分离单根毛囊并剥离毛乳头;配制5组细胞培养液,利用细胞免疫荧光染色的方法检测毛乳头细胞中α-平滑肌激动蛋白基因(α-smooth muscle actin,α-SMA)和CD133的表达;利用脂质体3000介导miR-206模拟物转染次级毛乳头细胞,qRT-PCR检测7个与毛囊周期变化相关基因的表达情况.本研究成功进行了毛乳头细胞原代和传代培养,毛乳头细胞3d即可贴壁并伴有迁出;同时添加双抗、雌二醇(β2 estradiol,β2)、胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的培养液中毛乳头细胞从贴壁时间和迁出效率及细胞活力上均优于其他组,建议绒山羊次级毛囊生长期毛乳头细胞培养液为改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture F-12,DMEM/F12)(1∶1)、10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、双抗(100 IU)、β2(0.3 μg/mL)、ITS(5.0 μg/mL)、EGF(7.0 μg/mL).与对照组相比,miR-206转染毛乳头细胞后,蛋白络氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 1,PTPNl)、骨形态发生蛋白2基因(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达量极显著升高(P＜0.01),BMP4表达量无显著差异(P＞0.05),与BCL-2相关的永生基因(BCL-2 associated athanogene 4,BAG4)、MAX二聚蛋白4基因(MAX dimerization protein 4,MXD4)、胰岛素样生长因子1基因(insulin like growth factor 1,IGF-1)和成纤维细胞生长因子受体2基因(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)表达量极显著下降(P＜0.01).经筛选分析BAG4可能是miR-206的候选靶基因.本研究成功对毛乳头细胞培养液进行了优化,转染的miR-206能够在绒山羊次级毛乳头细胞中稳定表达,初步判断其过表达对生长期毛囊的发育具有一定的抑制作用.本研究为进一步研究miR-206在毛囊周期发育中的分子机制提供了理论依据.     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

基于全基因组重测序技术的狮头鹅Indel标记分析

旨在利用重测序技术分析狮头鹅基因Indel差异并探讨其产蛋调控通路。本研究选用产蛋量有差异的成年狮头鹅和吉林白鹅母鹅各5只,采用全基因组重测序方法,对两个品种基因组水平的插入缺失突变情况进行比较分析。结果表明,测序共得到350.35 Gb数据,其中Q20与Q30平均值分别为96.74%、92.19%;通过注释分析发现了748 821.2个Indel变异位点。10只试验鹅的Indel位点在编码区（CDS）的分布趋势和数量与参考基因组相似,其中有11 737个Indel位点导致了插入或删除;在此基础上,进一步分析筛选产蛋相关通路,发现在GnRH信号通路、雌激素信号通路、催产素信号通路、催乳素信号通路以及孕酮介导的卵母细胞成熟通路中分别有15、1、1、1、18个变异基因参与狮头鹅产蛋调控。结果显示,通过Indel位点分析表明,GnRH信号通路、雌激素信号通路、催产素信号通路、催乳素信号通路和孕酮介导的卵母细胞成熟通路均与狮头鹅产蛋有关,并进一步筛选出可能的产蛋相关基因。这些数据将为我们研究狮头鹅繁殖性能提供有效基础和依据。     

杂合肽Melitten-cathelicidin_BF的生物信息学分析

[目的]为了深入研究杂合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性质,为抗菌肽开发利用提供新的思路。[方法]本研究将蜂毒肽（Melitten）和金环蛇抗菌肽（Cathelicidin_BF）进行融合构成新的多肽,利用在线生物分析软件进行了全面系统的生物信息学分析。[结果]杂合肽Melitten-cathelicidin_BF一级结构,含有56个氨基酸残基,包括14种氨基酸,分子量为6.47 kDa,理论等电点为12.20,为亲水性蛋白,有5个糖基化和2个磷酸化修饰位点。二级结构主要元件为α螺旋和无规则卷曲。[结论]该杂合肽无信号肽、无跨膜区,且该杂合肽为阳离子肽,该杂合肽为蛋白酶抑制剂类肽。     

HMGCR基因多态性与肉牛屠宰性状相关性分析

蛋白质作为功能基因表达的产物,直接或间接参与机体内各种生命代谢活动的调控,为人类认识各种生命活动的本质提供了直观的分子学基础.随着后基因组时代的到来,蛋白质组学必将在包括动物科学在内的众多生物学研究领域内发挥巨大的作用.论文介绍了蛋白质组学的研究现状及其在动物肉品质、奶品质、禽蛋、动物毛发和动物疾病等研究方面的应用,并对应用中的具体理论依据和技术手段进行说明.     

山羊绒毛干中线粒体DNA和核DNA的提取与PCR扩增

本研究以PCR缓冲液、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解提取液,建立了一种从山羊绒毛干中快速提取DNA的方法。结果表明,该方法不仅能从山羊绒毛干中提取出线粒体DNA和核DNA,而且能够有效地进行线粒体基因和核基因组基因的PCR扩增,为拓展羊绒样品在个体识别、遗传资源评价、分子进化和分子标记辅助育种等研究领域中的应用奠定基础。     

多种教学模式在《羊生产学》课程中的应用

《羊生产学》是动物科学专业本科生必修的一门重要基础课,该课程与畜牧生产密切相关,具有较强的实践性。随着现代经济的不断发展、人们生活及生产方式的改变,传统教育方式的弊端日益凸显,使得当代大学生对羊及羊产业缺乏足够的认识,这在一定程度上增加了本课程知识传授的挑战性。本文针对传统教学中存在的不足,充分考虑到该课程的实际应用性,从教学方法、教学内容和实践技能训练等方面入手,尝试对《羊生产学》课程中教学内容覆盖范围不合理、理论与生产实践脱节等难题进行探究性改革,从而提高教学质量,为培育高素质专业技术人才奠定良好基础。     

秦川牛ESRRα基因的多态性及其与肉质性状的关联分析

 雌激素相关受体α(Estrogen-related receptors α,ESRRα)是一个多功能蛋白,主要参与全身能量代谢,并且在脂肪细胞分化过程中起着重要作用。研究采用直接测序与限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP) 相结合的方法,对282头秦川牛ESRRα基因的第一内含子进行多态性检测,发现一个单核苷酸多态位点（SNP）(C147A)。通过分析得出：在这个秦川牛群体中存在2个等位基因,A和C,两个等位基因的频率分别为0.4025和0.5975,检测到3种基因型,AA、CA和CC,3种基因型的频率分别为0.1844,0.4363和0.3794。ESRRα基因与秦川牛肉质性状的关联分析结果表明：CC基因型对牛的背膘厚有较大影响 (P<0.05);而AA基因型和CA基因型个体的大理石花纹则显著高于CC型个体 (P<0.05)。     

新冠肺炎疫情背景下《兽医内科学》线上线下融合教学的构想

《兽医内科学》是动物医学专业本科教育的专业方向课,具有较强的理论性、实践性和系统性,是动物医学专业的临床主干课程之一,也是动物临床医学的核心课。目前,该课程主要以线下双语教学方式为主,但随着信息化教育技术不断发展及国际交流合作越来越普及化,全线下教学模式局限性日渐凸显,尤其面对2020年初新冠疫情的暴发,线上居家教学成为教师和学生教与学的唯一方式。线下线上融合的双语教学能更充分的利用在线优质教育资源,对于实现资源共享、推动兽医教育与先进国家接轨、培养综合型高级兽医专业人才、增强国际竞争力具有重大意义。本文拟借助超星学习通平台探索一种教学效果相对理想的《兽医内科学》线上线下融合教学模式,并在实践教学中应用推广,主要从教学内容、教学模式、网络平台、师资队伍、教材开发等诸多方面对教学资源进行补充与创新、继续发展和完善,目标在于将《兽医内科学》双语教学发展到高水平阶段,以满足学生的学习和发展需求。