基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近，笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒（PEDV），为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行，对实验室2018-2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因（spike）分子特征研究。结果表明：腹泻样本的PEDV检出率为42.2%（49/116，95% CI=33.1%~51.8%），并获得了13条完整的S基因序列，全长为4 149~4 170 bp，序列相似性为94.2%~99.9%，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%~98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群；SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支，且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程，以贝叶斯进化分析软件包（BEAST）进行分歧时间估算，结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年，早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间（2015.7年）；SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年，早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年，所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV，并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川，为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

兽医微生物学实验教学改革

为提高兽医微生物学实验教学质量,增强学生对实验操作技能的实践应用能力和创新能力,对传统实验课程教学进行探索性改革.通过加强实验室安全管理,改善实验室条件,优化课程体系,并将实验教学与科研创新有机结合,同时改革效果评价模式等,有效提高了兽医微生物实验教学质量,提高了学生学习积极性和自主性,提升了学生的综合实验素养.     

四川部分区域鸽源沙门菌耐药表型及耐药基因检测

为了解四川省成都市及周边区域鸽源沙门菌的耐药表型及耐药基因携带情况,通过常规细菌分离鉴定并结合PCR方法,获得42株鸽源沙门菌,采用K-B纸片法,选取20种抗生素,对42株鸽源沙门菌进行药敏试验,并结合PCR方法对其耐药基因携带情况进行检测。结果显示:受检菌对链霉素、四环素、多西环素耐药率为88. 1%;对阿莫西林耐药率为83. 3%;对头孢拉定、氨苄西林、萘啶酸的耐药率为81. 0%。42株沙门菌皆有不同程度的多重耐药性,其中33株同时耐4种以上抗生素,占检测菌株的78. 6%(33/42),主要的耐药谱为CTX-CRO-FLO-CPIOFL-AKN。42株沙门菌喹诺酮类耐药基因aac (6')-Ib-cr检出率最高,为88. 09%(37/32);氨基糖苷类耐药基因aadA1、aph (3)Ⅱ、aac(3)Ⅱ检出率分别为80. 95%(34/42)、76. 19%(32/42)、16. 67%(7/42);β-内酰胺类耐药基因blaTEM-1、bla CMY-2检出率分别为42. 86%(18/42)、19. 04%(8/42);四环素类耐药基因tet M、tet A、tet B检出率分别为40. 4%(17/42)、38. 09%(16/42)、9. 52%(4/42);磺胺类耐药基因sul2检出率为80. 95%(34/42);喹诺酮类耐药基因qnrA检出率为38. 09%(16/42)。结果表明:四川省成都市及周边区域鸽源沙门菌存在普遍耐药,且多重耐药较为严重,耐药基因携带率高。     

猪流行性腹泻病毒SCYA2204株的基因克隆及测序分析

为了解四川省雅安地区流行的PEDV的基因特征及遗传变异情况,本研究通过病毒RNA提取、RT-PCR、基因克隆及测序等方法获得一株PEDV SCYA2204的基因序列,利用生物信息学分析软件分析其核苷酸序列,并推导氨基酸的变异性和遗传进化特征。结果显示：SCYA2204是G2b亚型毒株,其S基因、ORF3基因、E基因、M基因、N基因与参考毒株的核苷酸序列同源性分别为92.5%～99.2%、96.0%～100%、97.0%～100%、97.4%～99.7%、95.2%～99.9%;由S基因构建的遗传进化树显示SCYA2204与5株四川往年流行毒株聚成一支,亲缘关系密切;与PEDV国内常用疫苗株CV777、AJ1102及四川往年流行毒株相比,SCYA2204 S蛋白存在10处氨基酸连续突变;与CV777和AJ1102比较,S蛋白核心中和表位共有2处氨基酸突变;此外,SCYA2204的S基因发生了重组事件,其主要亲本为G2b亚型的CH/SCXH/2018。上述研究表明,当前在雅安地区流行的PEDV毒株氨基酸序列发生了变异和重组,可能导致抗原性发生改变,影响现有疫苗的保护效力。     

副猪嗜血杆菌rfaD基因的克隆及原核表达

rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096 株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927 bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50 ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。     

羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡及免疫细胞因子的影响

旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响.在ORFV118基因克隆基础上,成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞,Western Blot...     

吡唑醚菌酯在水环境中的光解及微囊化对其光稳定性的影响

以紫外灯为光源,研究了吡唑醚菌酯在水环境中光化学降解及微囊化对其光稳定性的影响。结果表明:在紫外光下,吡唑醚菌酯在0.80~10.00 mg·L^-1浓度范围内的光解符合一级动力学方程,光解速率与初始浓度呈负相关;吡唑醚菌酯在不同水溶液中的光解速率由大到小依次为去离子水、自来水、池塘水、饮用纯净水和河水;在H₂O₂ 0.03~7.94 mmol·L^-1内,光解速率随着H₂O₂浓度的增大而增大,在7.94 mmol·L^-1时是吡唑醚菌酯单独光解的1.14倍。20%吡唑醚菌酯微囊悬浮剂在2.00、4.00、10.00 mg·L^-1浓度下,紫外光照射132 h的光解率低于57.90%,表明微囊化明显降低了吡唑醚菌酯在水中的光降解速率。研究结果将为吡唑醚菌酯的合理使用和评估其在水体中的安全风险提供依据。     

基于PEDV ORF3基因的强弱毒株鉴别方法的建立及初步应用

为了建立一种快速鉴别PEDV强毒株和弱毒株的RT-PCR方法,针对PEDV ORF3基因设计一对引物,优化其反应体系和退火温度,并测试其特异性和敏感性。结果显示,在退火温度55.2℃,上、下游引物各0.5μL时PCR扩增效果最理想。特异性试验结果显示本方法对9种常见猪病病原的核酸模板均不产生扩增条带;敏感性试验显示该方法的检测下限为T-ORF3_IS 272拷贝/μL和T-ORF3_VC 14.4拷贝/μL。将本试验建立的RT-PCR法与已建立的双重RT-PCR方法进行比较,结果显示两种方法符合率为99.2%,且本法的实际检出率更高。对120份临床样本检测结果显示,PEDV强弱毒株的阳性率分别为87.18%和84.21%,其中9份样本中同时检出2种PEDV毒株,但并未对检测方法的准确性造成影响。建立了一种基于ORF3基因的RT-PCR检测法,该方法特异性强、灵敏度高,可准确区分PEDV野毒株和弱毒株。     

四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PKV感染状况调查

为了解四川省部分猪场4种猪腹泻病毒的感染情况,为本地区猪腹泻的诊断和治疗提供依据,采用RT-PCR方法,分别对来自四川省成都、绵阳、德阳、眉山、资阳、雅安、内江、宜宾、达州等地9个规模化猪场的90份临床健康猪和130份腹泻猪的粪便样品,进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪嵴病毒(PKV)和猪A群轮状病毒(GARV)的检测。结果表明,在所有9个猪群中PEDV和PKV检出率达100%(9/9),且在部分猪群腹泻样本中的检出率可达到60%以上,表明此2种病原在检测猪场感染比较普遍。此外腹泻样本中TGEV和GARV阳性率分别为11.54%(15/130)、7.69%(10/130),表明该2种病原在本地区猪场仍有感染情况存在。对PKV的检测结果表明腹泻猪粪便中PKV的阳性率为43.85%(57/130),显著高于外表健康猪粪便样本23.33%(21/90),且PEDV和PKV的混合感染在4种病原混合感染类型中所占比例最大,推断PKV与猪只腹泻具相关性,PEDV和PKV具有协同致病的可能。     

基于网络药理学和分子对接探究白杨素和柚皮素抗PEDV的作用机制及试验验证

【目的】探讨白杨素和柚皮素抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的作用靶点和机制,为进一步以白杨素和柚皮素开发新型抗PEDV的治疗药物提供理论依据。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SEA Search Server和STITCH在线数据库获得白杨素和柚皮素的潜在作用靶点,同时检索GeneCards数据库获得PEDV对宿主的作用靶点,利用在线程序Draw Venny Diagram获取白杨素、柚皮素与疾病的交集靶点。通过STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过AutoDock Vina v 1.2.0软件对核心靶点及小分子进行分子对接,并分析白杨素和柚皮素与靶蛋白的结合能和结合模式,利用PyMOL v 2.5实现对接结果的可视化。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测白杨素和柚皮素对核心靶蛋白表达的影响。【结果】白杨素潜在抗PEDV的靶点有12个,其中白蛋白(ALB)、雌激素受体1(ESR1...