番茄溃疡病生防菌YH23的发酵条件优化及菌种鉴定

海洋是当前放线菌资源的重要来源,由于其独特的生态环境造就了代谢系统多样的放线菌,随着研究的深入,有望获得具有不同抑菌活性的有益菌株。从大连黄海海域海底沉积物样品中分离得到1株放线菌YH23,为进一步开发其在生物防治中的应用潜力,采用牛津杯法检测其发酵液对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的抑菌活性,并采用单因素试验与正交设计方法筛选出该菌株的最优发酵配方和发酵条件,同时通过形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析初步确定了该菌株的分类地位。结果表明:YH23发酵液对番茄溃疡病菌(Cmm)具有抑制活性;其优化后的发酵培养基组分为黄豆粉10g,地瓜粉10g,氯化钠2g,碳酸钙1g,去离子水1L;优化后的发酵条件为初始pH值6.0,发酵温度25℃,发酵时间5d,接种量8%,装液量75mL/250mL,转速为150r·min-1,优化后发酵液的最佳抑菌圈直径较初始发酵液增大47.2%;该菌株16S rDNA序列与密旋链霉菌(Streptomyces pactum NBRC 13433T)相似度为99.58%,聚类分析显示二者亲缘关系最近,结合形态特征及生理生化特性最终确定该菌株YH23为密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。     

瓜类枯萎病菌拮抗放线菌分离方法的研究

通过对土壤样品进行不同温度、不同孢子激活剂、不同抑制剂、不同培养基等条件的梯度试验,得到对黄瓜枯萎病菌有拮抗作用的土壤放线菌的分离方法:将土壤样品经100℃干热处理1 h,用0.05%的SDS稀释,分别涂布于含有1μg/ml青霉素的高氏合成1号琼脂、淀粉琼脂、腐植酸—维生素琼脂(HVG)组合培养基上,置于28℃培养7 d,并分离到69株瓜类枯萎病的拮抗放线菌。     

瓜类枯萎病拮抗放线菌H628的鉴定

对分离自东北地区针叶林土壤中的一株拮抗放线菌菌株H628进行了形态学、培养特征及生理生化分析,鉴定结果表明:放线菌H628在大多数培养基上生长良好,基内菌丝无横隔,不断裂,气生菌丝粉红色,生长茂盛,孢子丝呈松敞螺旋或直形.上述特征与弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)高度一致.聚类分析表明,二者的16S rDNA序列的同源性达到了99%.因此,可将放线菌H628定名为弗氏链霉菌H628(S. fradiae H628)     

响应面法优化小链霉菌产抗生素发酵条件

利用响应面法对分离于大连海域的番茄溃疡病生防菌株小链霉菌(Streptomycete parvus)PH33菌株产抗生素的发酵条件进行优化。首先通过二水平设计的Plackett-Burman试验分析7种因素中对小链霉菌产抗生素能力影响最主要的3种;然后运用爬坡路径法对这3种因子进行试验,获得这3种重要因子的最适范围。最后通过响应面分析得到3种重要影响因子的相互作用及最优条件。最终条件为发酵温度30.97℃、初始pH值6.91、每250mL三角瓶装液量101.08mL。优化后抑菌圈直径由29mm提高到38mm,提高31.03%。结果表明,数理统计试验设计和分析的方法可成功地用于小链霉菌产抗生素发酵条件优化且效果显著。     

一株拮抗番茄溃疡病菌的海洋放线菌的分类鉴定及活性测定

从大连海域采集的海泥样品中分离得到1株放线菌菌株PH33,根据其形态特征、培养特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析结果,鉴定该菌株为小链霉菌(Streptomyces parvus)。采用琼脂块法和牛津杯法测定了菌株PH33对番茄溃疡病菌的拮抗能力。结果表明:抑菌活性物质在100℃水浴加热、pH 2条件下的抑菌活性均不变,pH 12条件下抑菌活性稍有下降;紫外线照射不影响其抗菌活性。说明该菌株在预防和控制番茄溃疡病的发生及危害方面有潜在的应用价值。     

番茄叶霉病拮抗放线菌菌株A-10的鉴定

对分离自东北蔬菜保护地土壤的1株番茄叶霉病拮抗放线菌菌株A-10进行了形态学、培养特征及生理生化分析.鉴定结果表明:放线菌A-10除在ISP4培养基上不生长之外,在大多数培养基上生长良好,基内菌丝无横隔,不断裂,气生菌丝体形成孢子链,孢子丝呈波曲、直形或形成单环.上述特征与纤维素链霉菌(streptomyces cellulosae)高度相似.聚类分析结果表明,二者的16s rDNA序列的相似性达到了99%.因此,可将链霉菌A-10定名为纤维素链霉菌A-10(Streptomyces cellulosae A-10).     

利用降落PCR扩增KS基因

通过优化SDS法提取链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)和2株由生物技术与资源利用国家民委——教育部重点实验室分离获得的放线菌D8和D18基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增酮基合酶基因(ketosynthase,KS)。结果表明,扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致,降落PCR法较普通PCR法扩增KS基因特异性更高。使用普通Taq酶,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

6种链霉菌基因组DNA提取方法比较

采用优化SDS、SDS、优化CTAB、CTAB、液氮研磨、微波法分别提取委内瑞拉链霉菌基因组DNA,比较6种方法的差异,选出最佳提取方法分别提取S.fradiae,S.venezuelae,S.ambofa-ciens,S.glaucescens,S.coelicolor基因组DNA,并利用16S rDNA的通用引物扩增相应的目的基因。结果表明:6种方法制备的基因组DNA以优化SDS法和微波法为上选,后者的纯度高但量很少。优化SDS法是6种提取方法中最可靠的DNA提取方法,DNA量大,纯度高,可靠,可作为PCR反应的模板进行16S rDNA基因有效扩增。     

番茄煤霉病菌生物学特性研究

对番茄煤霉病病原菌———番茄煤污尾孢霉(Cercospora fuligenaeRoldan)进行了生物学特性及杀菌剂抑菌效果测定研究。结果表明:病菌在不同培养基上菌丝生长速度存在明显差异,以燕麦片培养基、PSA培养基为最适,其次为PDA和果煎汁培养基;病菌菌丝生长温度范围5~35℃,最适为25℃;病菌菌丝体致死温度为55℃、10m in。病菌pH值在3~12范围均可生长,以pH值3~4为最适;光照对病菌菌丝生长影响较小。病菌在黑暗条件下较易产孢。病菌分生孢子萌发温度为10~40℃,最适为25℃,高温对孢子萌发有抑制作用;分生孢子在1%的木糖、果糖、葡萄糖中萌发较好,但在水滴中萌发率较低;pH值2~12范围均可萌发,pH值6为最适;病菌分生孢子致死温度为54℃、10m in。     

链霉菌组合ST-2发酵条件优化及对黄瓜枯萎病的防治效果

为实现黄瓜枯萎病的生物防治,本研究对海洋拮抗放线菌组合Streptomyces spp.ST-2(包含菌株GQ-17、YH-91、YH-23)的发酵培养基配方及发酵条件进行了探讨,期望提高其生防效果和植株生长量。采用皿内共培养法、牛津杯法分别测定了3株生防链霉菌的共生性及单菌株抗菌活性;通过单因素试验和正交试验确定了ST-2组合最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件;通过盆栽试验研究了ST-2组合菌剂对黄瓜植株的促生防病效果。菌株GQ-17、YH-91和YH-23的无菌发酵液对黄瓜枯萎病菌Fusarisum oxysporum f.sp.cucumebrium抑菌圈直径分别为24.2、20.4和14.4 mm,且3株菌间无生长抑制,可共生;组合菌剂ST-2的最佳发酵培养基配方为:玉米粉8 g/L、黄豆粉10 g/L、氯化钠2.5 g/L、碳酸钙2.0 g/L,p H自然;当菌株GQ-17、YH-91和YH-23种子液以3:3:2配比,以3%接种量接入50 m L液体培养基中,31℃、150 r/min振荡培养5 d,其发酵液对黄瓜枯萎病具有最好的防治效果,相对防效达65.89%,且显著高于单菌株(19.94%,25.20%,42.88%)及申嗪霉素(39.50%)的效果。此外,ST-2组合菌剂施用后,处理植株株高(42.30 cm)和茎粗(6.84 mm)较对照(株高32.60 cm,茎粗6.07 mm)分别增加29.75%和12.69%,显著提升了植株生物量。