牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

小反刍兽疫病毒宿主细胞受体的研究进展

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种接触性的病毒性传染病,是我国农业农村部规定的、已被列入世界卫生组织的Ⅰ类动物疫病之一,主要宿主是绵羊和山羊.小反刍兽疫在世界范围内广泛传播,危害严重,其发病率高达100％,并且病死率占90％～100％,其对养殖业的发展造成严重的经济损失.目前,PPRV有两种己...     

牛病毒性腹泻病毒蛋白的免疫学特性以及相关疫苗研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)众多基因亚型毒株的流行及其宿主谱的扩大干扰着BVDV防控工作。欧洲国家采用全面检测和扑杀BVDV阳性牛的方法达到一定防控效果，但结合我国实际生产情况，使用疫苗防控BVDV仍是最优策略。深入了解病毒感染过程中BVDV蛋白与宿主免疫系统之间的“博弈”,将有助于研究人员在疫苗研发过程中有效规避抗原候选蛋白可能对免疫效果造成的干扰。此外，大力开发低成本、高效力的新型疫苗(如表位肽疫苗和病毒样颗粒疫苗)可以在整合病毒免疫优势抗原表位的基础上加强BVDV相关疫苗的生物安全性，满足用疫苗防控BVDV的要求。鉴于此，本文对BVDV蛋白免疫学功能与特性的研究以及BVDV疫苗开发的现状进行综述，以期为BVDV疫苗研发以及BVDV防控提供一些理论指导。     

羊边界病致病机制及宿主嗜性变化的研究进展

羊边界病病毒(border disease virus,BDV)属于黄病毒科瘟病毒属,经常在牛、羊等反刍动物群体间广泛流行传播,能以多种动物为宿主且对健康动物具有一定危害。BDV感染反刍动物可引起持续性感染和免疫抑制,给畜牧业造成严重危害,且在多个国家和地区呈现出一定的流行性趋势。目前尚无公认的有效疫苗来预防BDV,所以如何科学饲养以及做好安全防控就成了重中之重。本文对BDV在牛群、羊群内的传播进行研究分析,有助于人们对BDV可能造成的风险进行预估并进行防控。因此,从BDV的分子生物学、流行现状、流行病学、临床症状以及与牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的混合感染来进行研究分析,有助于人们深入了解BDV致病及传播扩散的生物学机制,为该病的诊断、防治和疫苗研发提供新思路和策略。     

一株牦牛源牛病毒性腹泻病毒毒株的分离鉴定及其遗传特性分析

通过病毒分离培养技术,从牦牛血清中分离获得一株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为GSTZ毒株。经电镜观察,GSTZ毒株的直径在50~60 nm。按Karber法测算,该病毒滴度为5.0×10^6.5 mL^-1[以组织半数感染量(TCID₅₀)计]。利用反转录PCR(RT-PCR)测定GSTZ毒株的完整开放阅读框(ORF),全长11 691 nt,将其与参考毒株ORF在核酸序列和同义密码子使用模式等方面进行分析,确定GSTZ毒株在遗传学特性上属于基因1型家族成员。在GSTZ毒株的完整ORF中,A+U的出现频率要高于G+C,而且,病毒同义密码子的使用模式体现出对U/A结尾同义密码子使用偏嗜性高的遗传学特征。GSTZ毒株明显降低了使用含有CpG二联核苷酸的同义密码子的频率。这有助于降低病毒对宿主细胞免疫系统的刺激强度,从而促进病毒的复制增殖。研究成果可为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料,并为BVDV不同基因型的抗原关系分析与BVDV疫苗的研制奠定基础。