抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因

灵芝细胞在液体静置和振荡培养方式下,抗癌物质灵芝酸的产量有显著的差别。采用抑制消减杂交法分离了灵芝细胞在两种不同培养方式下差异表达的基因,对构建的差减文库进行筛选后获得了一个灵芝的EST序列。根据这个EST序列,采用RACE-PCR的方法成功克隆到了灵芝G蛋白β亚基（Gb）基因（GenBank登录号GQ293361）。序列分析显示这个基因cDNA全长1217bp,编码了313个氨基酸。同源性分析表明其编码的氨基酸与其他蘑菇类真菌Gβ的氨基酸序列同源性较高,与Coprinopsis cinerea（XP₀01830441.1）、Lentinula edodes（AAP13580.2）和Schizophyllum commune（XP₀03029882.1）的一致性分别达到91%、91%和90%。实时荧光定量PCR结果表明这个基因在液体静置培养方式下的表达量显著高于振荡培养。     

改性核桃壳固定化脂肪酶研究

以核桃壳为原料,采用磷酸活化法制备炭化核桃壳,接着通过表面氧化和硅烷化对其进行改性处理使表面连接上疏水性有机官能团,并以此为载体来固定化脂肪酶,研究了不同固定化条件对酶活力的影响以及固定化酶的稳定性。结果表明,最佳工艺条件为酶质量浓度16 mg/mL,缓冲液pH值5.0,固定化时间3 h,固定化温度30℃。在此条件下最高酶活力可达166 U/g,稳定性试验表明,固定化脂肪酶具有较好的热稳定性,而且反复使用10次后,固定化脂肪酶仍可保留60%以上的初始酶活。     

胺鲜酯对雨生红球藻虾青素积累和合成相关基因的影响

非生物胁迫结合诱导剂提高雨生红球藻虾青素产量已被广泛研究。为了提高雨生红球藻虾青素含量,本研究在高光照下外源添加胺鲜酯(DA-6)诱导藻细胞积累虾青素,并研究了胺鲜酯对中间代谢产物(β-胡萝卜素,角黄质)含量及虾青素合成相关基因表达的影响。研究显示,0.1 mmol/L DA-6可显著(p0.05)提高虾青素产量,其最大含量可达24.94 mg/g,是对照组(16.43 mg/g)的1.52倍;此外,虾青素合成相关基因pds、ptox、bkt、chy表达也呈现出了不同水平的上调。表明强光照联合胺鲜酯诱导促进雨生红球藻中虾青素的大量积累可能与虾青素生物合成相关基因的高表达有关。为提高天然虾青素的产量和研究诱导虾青素合成机制提供一些参考资料。     

与灵芝酸生物合成相关的细胞色素P450基因的筛选与分析

首先采用荧光定量PCR的方法通过分析在液体静置和振荡培养条件下基因的表达量对灵芝(Ganoderma lingzhi)细胞中14个与类固醇结合的P450基因进行筛选;其次在不同培养条件下(振荡、静置、静置钙离子添加和静置氮缺陷)通过分析灵芝酸T积累与P450基因表达的相关性对差异表达显著的P450基因进行进一步筛选;最后通过反义RNA技术对所筛选出的基因进行沉默,分析在灵芝细胞内沉默该基因对灵芝酸T含量的影响。结果表明:14个P450基因中,5个基因(cyp512a3、cyp512a11、cyp5144n1、cyp512u4、cyp512v2)的表达量在静置培养条件下显著高于振荡培养条件,差异表达倍数分别为7.2、3.7、3.4、89.8、63.4;cyp512v2基因的表达与灵芝酸T的积累显著相关;三株cyp512v2基因沉默效率较高的菌株中灵芝酸T含量分别比野生型菌株的含量降低13%、69%、66%,表明cyp512v2在灵芝酸T的生物合成过程中具有重要的作用。     

灵芝细胞中异源表达透明颤菌血红蛋白基因提高胞外多糖的产量

在灵芝(Ganoderma lingzhi)中异源表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因,采用一氧化碳差异波谱分析的方法检测转基因菌株的生物活性,并对野生型菌株和工程菌株进行发酵,通过荧光定量PCR对灵芝多糖生物合成途径上的葡萄糖磷酸变位酶(α-phosphoglucomutase,PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase,UGP)和β-1,3-葡聚糖合酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)3个基因的转录水平进行分析。研究表明:透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)在灵芝中能够成功表达,并且具有生物活性;工程菌株中胞外多糖的最高产量达0.83g/L,比野生型菌株提高了88.6%;与野生型菌株相比,工程菌株中多糖生物合成途径上PGM、UGP和GLS基因的相对表达量分别是1.52、1.55和3.85。异源表达透明颤菌血红蛋白基因是提高灵芝胞外多糖产量的一种有效方法。