抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因

灵芝细胞在液体静置和振荡培养方式下,抗癌物质灵芝酸的产量有显著的差别。采用抑制消减杂交法分离了灵芝细胞在两种不同培养方式下差异表达的基因,对构建的差减文库进行筛选后获得了一个灵芝的EST序列。根据这个EST序列,采用RACE-PCR的方法成功克隆到了灵芝G蛋白β亚基（Gb）基因（GenBank登录号GQ293361）。序列分析显示这个基因cDNA全长1217bp,编码了313个氨基酸。同源性分析表明其编码的氨基酸与其他蘑菇类真菌Gβ的氨基酸序列同源性较高,与Coprinopsis cinerea（XP₀01830441.1）、Lentinula edodes（AAP13580.2）和Schizophyllum commune（XP₀03029882.1）的一致性分别达到91%、91%和90%。实时荧光定量PCR结果表明这个基因在液体静置培养方式下的表达量显著高于振荡培养。     

定向采收‘沪农灵芝1号’高三萜和水溶性多糖原料研究

采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS/MS）法和高效排阻色谱-多角度激光散射（HPSEC-MALLS）法检测灵芝（Ganoderma lucidum）‘沪农灵芝1号’不同生长期（接种后2～7个月，分别命名为P1～P6）子实体和菌基中三萜和水溶性多糖含量，并结合子实体和菌基的产量计算三萜和水溶性多糖的产量。结果表明：子实体中灵芝酸C2、G含量在P1、P2期较高，灵芝烯酸B和灵芝酸D、F、DM含量在P2期最高，灵芝酸B、A、S、T和总三萜含量在P1期最高；菌基中灵芝酸C2、A、D、DM和灵芝烯酸B含量在P1期最高，灵芝酸G含量在P 5期最高，灵芝酸B、S含量在P 6期最高，灵芝酸F含量在P 1、P 6期较高，灵芝酸T、总三萜含量在P 5、P 6期较高。子实体中灵芝酸C2、G、B、D、F、DM，灵芝烯酸B，总三萜产量在P2期最高；灵芝酸A产量在P3期最高；灵芝酸S、T产量在P1期最高。菌基中灵芝酸C2、G、B、A、D、F、DM，灵芝烯酸B产量在P1期最高；灵芝酸S、T产量在P2期最高；总三萜产量在P1、P2期较高。子实体和菌基中的水溶性多糖含量和产量均在P1期最高。研究结果将为‘沪农灵芝...     

振荡时间对阿魏侧耳液体培养效果的影响

试验研究了3个阿魏侧耳菌株在三种不同的液体培养条件下菌丝体的干重。培养液的pH值、电导率、单糖、总糖及蛋白质的含量的变化以及滤纸纤维素酶、漆酶、多酚氧化酶活性。结果表明：连续振荡的菌丝干重、各种酶活性比半振荡、静置培养的高，其中华阿魏菇在连续振荡培养中表现最好，间歇振荡培养的整体表现最差，在静置培养与间歇振荡培养中，K8的表现好于其它两个菌株。     

不同灵芝菌丝体中三萜与多糖含量的比较

根据十九种不同来源的灵芝菌株的生长速度及长势，从中选出了菌丝体阶段生长性能良好的10个菌株进行液体培养，并测定了菌丝中三萜和多糖的含量。结果表明，不同灵芝菌株在三萜和多糖含量上存在着一定的差异，其中多糖含量以汉城2号，日本灵芝，南韩灵芝为高；三萜含量却以韩国灵芝、灵芝0772、灵芝0771为高，并且二者的含量不存在必然的联系，这为灵芝优良品种的筛选提供了理论依据。     

原生质体融合选育富硒高产灵芝的研究

以两株不同性状的灵芝菌株为亲本,采用化学融合方法对其进行原生质体融合选育,筛选与亲本酯酶同工酶酶谱存在显著差异和拮抗试验呈阳性的融合菌株,并分别以液体发酵菌丝生物量、富硒液体培养菌丝体中硒含量和固体栽培时子实体生物转化率和灵芝菌株的富硒能力为初筛和复筛标准,经遗传稳定性试验验证,筛选到了一株灵芝高产菌株RG1108,编号为YG1,其灵芝子实体生物转化率、固体富硒栽培灵芝子实体和孢子粉中的硒含量分别较对照提高了18.48%、21.78%、16.19%,遗传性状稳定。结果表明:原生质体融合选育富硒高产灵芝是一种比较成功的灵芝育种手段。     

转哺乳动物cyp2e1基因矮牵牛耐甲醛胁迫的生理机制

细胞色素P450 CYP2E1酶主要存在于哺乳动物肝细胞中,在代谢异源有机物方面起着重要作用。前期研究发现,转cyp2e1矮牵牛显著提高了对甲醛的抗性。以转cyp2e1矮牵牛为试验材料,分析其对甲醛胁迫响应的相关生理指标。结果显示,在甲醛胁迫下,转cyp2e1矮牵牛细胞中的MDA含量低于转gus和野生型矮牵牛,SOD和POD活性均高于转gus和野生型,乙醇脱氢酶(ADH)活性稍有增强,且消耗更多的谷胱甘肽。此外,在甲醛胁迫下,转cyp2e1矮牵牛的IAA、ZRs和ABA含量呈现下降而GA含量呈现上升趋势;但转gus和野生型矮牵牛IAA、ZRs和ABA含量呈现上升而GA含量呈现下降趋势。转cyp2e1矮牵牛在含有50 mg·L-1甲醛的处理液中孵育72 h后,处理液中甲醛含量接近为0;而转gus和野生型处理液中仍有近50%的甲醛。     

废弃葡萄枝蔓栽培灵芝的适宜菌株筛选

为筛选适合以葡萄枝屑替代部分木屑为原料进行栽培的优良灵芝菌株,采用果园废弃的葡萄枝屑为主料,对8个灵芝菌株进行栽培试验,考察产量和生物转化率等指标,并检测其子实体和孢子的灵芝多糖及三萜含量,进行综合评分。结果:子实体和孢子产量、生物转化率、子实体和孢子的三萜含量均以GH8为好,其综合评分为83.24,也最高;子实体多糖则以圆8较高。8个菌株的多糖和三萜酸含量均超出国家药典标准。因此GH8可作为葡萄枝屑栽培灵芝的适宜菌株。     

超声波法提取灵芝多糖的研究

通过单因素考察及正交实验优化了用超声波法提取灵芝多糖的实验条件 ,并与酸提取方法进行了比较。结果显示在灵芝干粉中加入 6 2 5倍体积的水 ,在pH2 0的条件下用超声波提取 4 5min得到的灵芝多糖的量最多。与酸提取法相比 ,超声波法的粗提物提取率稍高(分别为 11 0 5 %和 13 85 % ,P >0 0 5 ) ;但提出物中的糖含量明显增加 (分别为 2 2 4 1%和 34 6 0 % ,P <0 0 1) ,大分子杂质明显减少 (分别为 1 4 5 %和 0 6 8% ,P <0 0 1)。     

不同灵芝菌株富硒能力的比较研究

通过在不同浓度富硒PDA平板培养基上灵芝菌丝的生长情况及在添加了亚硒酸钠的液体培养基中进行摇瓶培养,测定灵芝菌丝体的生物量及总富硒量,比较不同灵芝菌株的富硒能力,最后从15个不同灵芝生产菌株中筛选出一株对高浓度硒有很好耐受能力且富硒能力强的菌株惠州灵芝。在适宜的条件下进行液体摇瓶培养,7d后其菌丝体的硒含量为2386μg/g,总富硒量为3784.2μg/100mL。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

灵芝细胞中异源表达透明颤菌血红蛋白基因提高胞外多糖的产量

在灵芝(Ganoderma lingzhi)中异源表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因,采用一氧化碳差异波谱分析的方法检测转基因菌株的生物活性,并对野生型菌株和工程菌株进行发酵,通过荧光定量PCR对灵芝多糖生物合成途径上的葡萄糖磷酸变位酶(α-phosphoglucomutase,PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase,UGP)和β-1,3-葡聚糖合酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)3个基因的转录水平进行分析。研究表明:透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)在灵芝中能够成功表达,并且具有生物活性;工程菌株中胞外多糖的最高产量达0.83g/L,比野生型菌株提高了88.6%;与野生型菌株相比,工程菌株中多糖生物合成途径上PGM、UGP和GLS基因的相对表达量分别是1.52、1.55和3.85。异源表达透明颤菌血红蛋白基因是提高灵芝胞外多糖产量的一种有效方法。     

灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子基因组RAPD分析

以获得弱木栓质化灵芝菌株为目的 ,利用液体培养 4d的灵芝菌丝体和培养 3d的糙皮侧耳菌丝体为材料 ,在PEG Ca2 +系统中诱导原生质体融合 ,获融合子 19株 ,融合率为 1.9×10 -5。根据其生物学特性 ,选取F3、F8两融合子及两亲本菌株的基因进行RAPD分析。结果表明 ,两亲本的核物质在融合子中发生了重组 ,并影响了酶蛋白的表达 ,而融合子在DNA水平上更接近灵芝     

越橘VcLon2蛋白酶在转化烟草衰老中的作用

植物衰老往往伴随着过氧化物酶体功能紊乱,Lon2蛋白酶对过氧化物酶体的功能和结构的维持具有重要作用,但目前未见其与衰老相关性的报道。从越橘（Vaccinium ssp.）中克隆了Lon2全长cDNA序列,命名为VcLon2（KX611379）,并通过烟草中NbLon2基因沉默（Virus Induced Gene Silence,VIGS）技术处理和转VcLon2基因对该基因功能进行研究。结果表明,NbLon2沉默本氏烟植株矮小,叶片小且黄化严重,而VcLon2超表达本氏烟植株鲜绿且粗壮;NbLon2沉默植株叶绿素含量仅为对照的一半,H2O2含量及膜脂过氧化程度也显著高于对照,VcLon2超表达植株则相反。同时,抗氧化酶CAT基因的转录水平在本氏烟各株系中无显著差异,但NbLon2沉默植株内CAT酶活性仅为对照的62.62%,表明Lon2蛋白酶对过氧化物酶体内蛋白质结构和功能的维持发挥着重要作用。此外,NbLon2沉默植株蛋白羰基化程度显著高于对照,植物衰老标记基因SAG12表达量为对照的15 642.2倍。以上研究均表明,Lon2蛋白酶缺失显著加剧光合色素降解、破坏细胞膜系统、羰基化蛋白大量积累等;VcLon2蛋白酶对植物健康维系及衰老延缓等具有重要作用。     

三株野生重伞灵芝的鉴定及其多糖、三萜含量分析

采用形态鉴定、ITS鉴定和ITS-RFLP分子标记方法对采集自福建的3株野生灵芝进行鉴定,并将其生物学特性及化学成分与赤芝(Ganoderma lingzhi)菌株ZK进行比较。结果表明:采集的3株野生灵芝为重伞灵芝(G.multipileum)。与赤芝菌株ZK相比,3株野生重伞灵芝菌株LQ、LJ和Y1菌丝生长速度快(P0.01),LQ、LJ、Y1最适生长温度分别为32、32、34℃,均高于赤芝ZK;供试菌株均偏好酸性生长环境;重伞灵芝LQ和Y1的产量分别为每袋(12.1±1.3)、(11.7±0.9)g,达到ZK产量(17.6±1.8)g的66%以上。Y1与LQ的子实体多糖含量分别为(12.9±0.1)、(10.7±0.3)mg/g,高于赤芝ZK的子实体多糖含量(9.2±0.2)mg/g(P0.01);LJ、Y1的三萜含量约为7.5mg/g,LQ的三萜含量为(6.5±0.3)mg/g,分别是ZK三萜含量的84.27%和73.03%。从HPLC图谱可知重伞灵芝有许多赤芝没有的峰,三萜酸的种类比较丰富。     

灵芝发酵液体种子培养条件研究

以菌丝体生物量为主要指标,结合发酵液多糖含量,研究灵芝发酵液体种子培养的营养因子和非营养因素.结果表明,适宜灵芝G5760菌株发酵液体种子的培养基配方为麦麸粉5%,黄豆饼粉3%,KH2PO40.10%,MgSO40.09%;而优化发酵条件为初始pH5.5,装液量32%,菌种种龄6d,接种量10%,培养时间8～9d.     

不同生长期灵芝子实体三萜酸和多糖含量测定

分别采用HPLC法和药典法测定不同生长期灵芝子实体中三萜酸和灵芝多糖的含量。HPLC法色谱条件:色谱柱为Alltech Alltima C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.04%甲酸溶液,检测波长254 nm,流速1.0 m L/min,柱温15℃。结果:灵芝酸C_2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D和灵芝酸C_1的线性范围为5.9~42.0μg/m L,r为0.999,加样回收率为96.42%~104.14%。表现方法可行、重现性好,能定量测定灵芝中三萜酸和多糖的含量。     

溶氧控制条件对深层灵芝发酵生产灵芝酸产量的影响

以灵芝真菌为试材,研究了10L发酵罐发酵培养好氧型灵芝真菌条件下,溶氧控制条件对生产灵芝酸产量的影响。结果表明:溶氧对灵芝真菌发酵生产灵芝酸的影响较大,高通气量有利于缩短发酵时间,适宜的通气量为0.4L·L-1·min-1,此条件下,菌体和灵芝酸的最大产量分别为8.27g/L和171.26mg/L;相对初始发酵条件,菌体和灵芝酸最大产量分别提高13.13%和13.28%;相对于低通气量,菌体和灵芝酸达到最大产量的时间缩短12h;表明0.4L·L-1·min-1的通气量较适宜于10L发酵罐发酵生产灵芝酸。     

深层发酵灵芝高产菌株筛选初探

将从各地收集到的24个灵芝菌株进行深层发酵培养，通过比菌丝生长速度和发酵生物量，筛选出8个优良菌株。根据菌株间拮抗反应及蛋白酶同工酶分析结果，确定8个菌株中的G2和G15、G33和G27为同一菌株，属同株异名，进一步比较8个菌株的菌丝发酵生物量，胞内，胞外多糖含量等指标，确认菌丝发酵生物量，胞内多糖含量较高的灵芝0770为液体深层发酵首选菌株。     

原木灵芝孢子研究：（Ⅲ）与木屑袋栽灵芝孢子的鉴别

原木灵芝孢子与木屑袋栽灵芝孢子可以鉴别如下:1.在扫描电镜下,前者形态饱满,后者大多数孢壁内陷;2.X-射线能谱面扫描分析结果表明,两者Mg、Al、Si、P、S、Cl、K、Ca、Fe、Ni等无机元素相对含量差异显著,前者Si、Ca含量较高;3.高效液相色谱分析结果表明,前者灵芝酸(Ganoderic acid)A、B等灵芝三萜酸含量较高,而后者未检出Ganoderic acid C;4.孢子粉经乙醚脱脂后用乙醇回流提取、浓缩成浸膏,前者提取率(固形物含量)达4.2％～4.8％,而后者仅为1.9％～2.1％。     

查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响

从桃（Prunus persica）果皮中克隆了493 bp的查耳酮合酶（Chalcone Synthase,CHS）基因片段,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体TRV-LIC-CHSi,通过农杆菌渗入法沉默目的基因CHS的表达,从而研究CHS在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰CHS基因的表达后,CHS的表达量降低88.8%,果皮中花青素糖苷含量下降87%,槲皮素糖苷含量下降35%,绿原酸含量升高57%,原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明,沉默CHS基因,会使整个花色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS基因调控着类黄酮类物质的代谢方向,是花色苷代谢途径中的重要基因。