转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

灰海马染色体制备及核型分析

为了解灰海马的细胞遗传学特征,便于今后开展灰海马的种质评价与鉴定、规模化人工繁育、亲缘关系研究及人工选育等工作,实验以雌雄灰海马的背鳍为材料,采用秋水仙素浸泡和常规热滴片法制备染色体标本。借助Photoshop图像软件,将同源染色体配对、拼贴,做出染色体核型图。采用Image J软件的自定义曲线测量功能,以着丝粒的中心位置为起点,顺着染色体弯曲的形态,到染色体臂末端为终点,测量线段长度,得出图片中染色体的臂长,根据相同放大倍数下标尺的测量值,换算出染色体的实际臂长。根据臂比值,将染色体进行配对、分类后,得出灰海马的染色体核型公式。结果显示,灰海马的背鳍组织可作为其染色体制备的理想材料,实验选用的染色体制备方法能获得图像清晰、形态良好的细胞分裂相。此法简单、效果好,解决了海龙科鱼类染色体制备的难题;灰海马具有22对染色体,二倍体染色体数目2n=44,雄鱼的染色体核型公式为2n=2sm+20st+22t,雌鱼的染色体核型公式为2n=1m+2sm+20st+21t,雌鱼存在性染色体异型的现象,因此灰海马的性染色体为ZW/ZZ型。     

应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

红花CDPK基因家族的鉴定及表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)是植物细胞内Ca²⁺信号识别及转导的重要媒介，在植物的生长发育以及逆境响应过程中起着重要的作用。本研究通过多种生物信息学的方法和手段，对鉴定出来的30个CDPK基因进行分析鉴定，结果显示30个CtCDPK基因所编码的氨基酸分子量为47 781.96～93 251.66 ku,等电点为5.09～9.27;基因结构预测结果表明，所有CtCDPK基因均含有6～13个外显子；染色体定位结果表明，30个CtCDPK基因分别定位在10条染色体上，其中8号染色体上最多，有5个，2号、4号染色体上没有；系统发育树分析结果显示将其分为6个亚家族；表达分析结果表明CtCDPK基因在不同组织、不同发育阶段中表达模式有所差异。     

利用流式细胞仪鉴定梨种质资源染色体倍性

以260份梨种质资源为试材,采用流式细胞仪对梨种质资源的倍性进行了鉴定,幵与前人用去壁低渗Giemsa染色法的鉴定结果进行了比较,以期为梨种质资源的创新和利用提供参考。结果表明:休眠期水培幼嫩叶片和早春嫩叶是梨种质资源倍性鉴定最理想的试验材料;供试的21份多倍体材料的倍性与前人鉴定结果一致,‘沙01’与前人鉴定结果存在分歧,幵新収现9份三倍体种质,分别为‘细皮梨’‘黑酸梨’‘冀蜜梨’‘世纪梨’‘敦煌香水梨’‘Beure Bosk’‘William Laspave’‘Yakumo’‘Butirra Rosata’;流式细胞仪法是进行梨种质资源倍性鉴定高效、快捷的斱法,克服了去壁低渗Giemsa染色法操作难度大、耗时长的不足,缺陷是不能获得更详细的染色体特征信息。     

长足大竹象染色体核型分析

以长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti Guer雄性成虫精巢为实验材料,采用醋酸洋红压片法观察了长足大竹象染色体的数目、形态等,并对其染色体核型特征进行分析。结果表明,长足大竹象染色体数目2n=22,其中常染色体10对,性染色体1对,均为中部/亚中部着丝粒染色体,NF=22;性别决定机制为Xyp型,核型公式为2n=22=16m+4sm+Xyp;最长染色体与最短染色体比大于4∶1,臂比大于2∶1的染色体百分比为0.1,故长足大竹象的染色体核型为2C型,未观察到次级缢痕及随体的特征。     

辣木的染色体制片优化及核型分析

以辣木分生组织为材料,采用酶解去壁低渗法制片,探讨不同取材部位、预处理方式和酶解时间对辣木染色体制片的影响,并对其进行核型分析,以期为辣木的起源、演化及遗传育种提供一定理论依据。结果表明:以辣木新枝茎尖为最佳取材部位,用饱和对二氯苯预处理2 h,再用4%纤维素酶和5%果胶酶混合物酶解4 h,制片所得染色体效果最佳。核型分析表明,辣木染色体属于小染色体,有28条,核型公式为2n=2x=2n=28m,属于1B类型,核型不对称系数60.29%,核型对称程度较高,这表明辣木在进化中可能处于比较原始类型。     

一种改进的大麦根尖染色体压片法及其应用

以大麦根尖为实验材料,采用改良的苯酚品红为染色液,在《遗传学实验》的基础上探索适宜的预处理时间、解离时间和染色时间,省略了纤维素酶和果胶酶处理步骤,形成了一套快速、简单的大麦根尖压片方法,该方法获得的染色体图像清晰,便于计数,可用于大麦倍性鉴定和染色体变异方面的研究。     

浒苔染色体制备及核型初步分析

由于浒苔染色体制备难度较大,至今还没有准确染色体数目及核型分析报道。以引发我国黄海绿潮优势种浒苔(Ulva prolifera)为研究对象,采用酶解-荧光法制备浒苔染色体,并比较分析染色体制备过程中秋水仙素预处理时间、酶解时间和滴片高度等3个关键因素对染色体制片效果的影响,以建立浒苔染色体制备方法。结果表明:用质量浓度为0.2%的秋水仙素处理12 h,染色体浓缩程度适宜,分散均匀,形态清晰;用质量浓度为2%的纤维素酶、果胶酶、离析酶,混合酶解20 h效果最好,能去除细胞壁、细胞膜和多糖物质;30 cm高度下滴片,能使细胞分散均匀,可以获得质量较高的浒苔染色体。核型分析显示,浒苔雌、雄配子体染色体数目为9条,孢子体染色体数目为18条。研究结果可为未来浒苔遗传特征分析以及浒苔功能基因定位研究奠定基础。