microRNA-let-7家族在约克夏猪甲状腺生长发育过程中的表达分析

miR-let-7广泛参与动物组织器官发育调控,是研究猪甲状腺发育的重要候选miRNAs。为了研究miR-let-7家族在约克夏猪(Sus scrofa)甲状腺生长发育过程中的作用,本实验一方面通过对不同发育阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)的猪甲状腺组织切片进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),研究甲状腺发育形态学的变化;另一方面,采用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和荧光定量PCR技术鉴定miR-let-7家族在不同生长阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)约克夏猪甲状腺中的表达。HE染色结果发现,甲状腺滤泡随着日龄的增加逐渐增大。原位杂交结果显示,miR-let-7主要位于甲状腺的滤泡上皮细胞中,并且let-7的表达在出生后有先减少后增加的态势。通过荧光定量PCR结果发现,在生长期随着日龄的增加,let-7d-5p、let-7f和let-7g的相对表达量逐渐上升,let-7c、let-7d-3p、let-7e和let-7i的表达先升后降。研究结果提示,约克夏猪甲状腺miR-let-7的表达直接或间接影响甲状腺激素水平的变化,在甲状腺生长发育中发挥了重要的作用,为深入研究猪的生长发育提供了一个新的思路。     

大豆GmFTL3和GmFTL5启动子的组织特异性表达分析

大豆（Glycine max (L.) Merr.）GmFTL3和GmFTL5基因具有很高的序列相似性,均参与大豆开花调节,但表达模式并不相同,本研究以启动子为突破口,分析这两个基因之间的表达差异。从大豆品种天隆1号中克隆GmFTL3和GmFTL5的启动子,构建载体pGmFTL3pro::GUS和pGmFTL5pro::GUS,转化拟南芥进行GUS染色分析。结果显示：无论长日条件还是短日条件,苗期和花器官中GmFTL3启动子均不驱动GUS基因在拟南芥中表达,而GmFTL5启动子则驱动GUS基因在拟南芥中表达,且在苗期的不同阶段呈现组织表达特异性。在花器官中,GmFTL5启动子驱动GUS基因主要在花萼、花瓣、花药和花粉粒中表达。实时定量结果显示,在大豆中,GmFTL3和GmFTL5基因均有表达。综上所述,大豆GmFTL3启动子在大豆中有活性但在拟南芥中无活性;GmFTL5启动子在大豆和拟南芥中均有活性,但表达可能存在差异; GmFTL5启动子在花器官中表达可能暗示GmFTL5基因与花器官发育有关。     

RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

原位杂交技术及其在甘蔗研究中的应用

介绍了植物染色体原位杂交技术的产生、发展过程,以及该技术与其它生物学技术相结合而形成的一些新技术,如:细菌人工染色体荧光原位杂交、DNA纤维荧光原位杂交、基因组原位杂交、原位PCR技术等。综述了这些技术在甘蔗研究中的应用情况。     

大鼠实验性胃溃疡自愈期间脾脏TFF3 mRNA的变化

目的探讨大鼠试验性胃溃疡自愈期间脾脏中肠三叶因子(intestinal trefoil factor,TFF3)基因的表达和变化。方法胃前壁胃黏膜下注射冰乙酸制备大鼠胃溃疡模型,原位杂交技术(ISH)检测正常组(6只)、盐水组(28只)和溃疡组(35只)雄性大鼠脾脏TFF3 mRNA的表达。结果 TFF3 mRNA阳性反应物呈灰蓝色颗粒状分布于细胞胞质中;TFF3 mRNA在正常组和盐水组大鼠脾脏中表达较弱;在溃疡组明显升高(P<0.05或P<0.01﹚。1～6d阳性细胞数密度逐渐增高,6d达到峰值,10～23d逐渐下降,但维持在较高水平;2d、4d和6d阳性细胞数密度与正常组和盐水组相比明显增高(P<0.01)。结论脾脏可以通过自身合成TFF3发挥作用在胃溃疡大鼠脾脏中呈高水平表达,推测可通过提高机体免疫反应性及促进胃溃疡愈合。     

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)自然感染三疣梭子蟹

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。     

大豆GmGBP1基因启动子的光周期响应元件TCT-motif功能分析

GmGBP1基因的启动子的多态性位点SNP-796与生育期密切相关，SNP-796G为缩短大豆生育期的优异等位基因。本研究运用生物信息学手段分析发现，等位基因SNP-796 G→A变异会导致TCT-motif光效应元件的变异。将包括SNP-796位点的GmGBP1基因的启动子片段与Luciferase报告基因融合构建植物表达载体并转化烟草，结合烟草叶片中的农杆菌瞬时表达试验，分析了该启动子中TCT-motif顺式作用元件的功能。结果显示，TCT-motif受短日照条件诱导，引起Luciferase基因的表达显著上调。在短日照条件下，TCT-motif可能通过增加GmGBP1基因mRNA的表达量，从而缩短大豆品种的生育期。       

DNA分子原位杂交在植物分子细胞遗传学研究中的应用

DNA分子原位杂交（in situ hybridiation）是植物分子细胞遗传学研究的重要工具。本文简要回顾了DNA分子原位杂交的起源和发展,详细综述了基因组原位杂交（genomic in situ hybridization, GISH）在植物细胞遗传学研究中的应用以及荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）在物理作图和染色体识别中的应用。文中还介绍了Fiber-FISH、BAC-FISH以及Immuno-FISH等新兴技术。最后对FISH技术进行了展望。