转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

标准物质具有特定量值、均匀性和稳定性三大典型特征,也是其作为测量标尺的依据。转基因生物标准物质是我国转基因产品标识制度顺利实施的关键技术支撑之一。文章以转基因玉米TC1507为对象,制备了转化体特异性的新型质粒DNA标准物质pTC1507,并对其均匀性、稳定性、量值进行了评价和测定。测试结果表明,制备的质粒DNA标准物质具有良好的瓶间和瓶内均匀性,pTC1507稳定性可靠,可以在-20 ℃稳定放置6个月以上。经过测序和实时荧光定量PCR定值以及不确定度评估,pTC1507标准物质的量值是1.01±0.053。均匀性、稳定性和量值结果表明,研制的转基因玉米TC1507质粒分子标准物质符合标准物质的典型要求,可以代替传统的基体标准物质应用于转基因玉米检测,解决传统标准物质获取困难、制备复杂、成本高等不足。     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...     

转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910,扩展标准不确定度（K=2）为0.013。     

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导，将抗真菌病的几丁质酶基因，导入默经江省栽培大豆一东农３７号，吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽，并再生植株，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中，有７株呈阳性反应，证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

东方山羊豆水通道蛋白基因的克隆及初步分析

根据已知EST片段结合RT-PCR和RACE技术,从东方山羊豆(Galega Orientalis)中克隆到一个水通道蛋白(AQP)基因,命名为GoAQP(GenBank登录号:HM 803185)。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1258bp,开放读码框(ORF)870 bp,编码289个氨基酸。GoAQP包含MIP家族信号序列HINPAVT/SFG,高等植物PIP高度保守序列GGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。与拟南芥AQP基因家族的系统进化分析表明,GoAQP属于PIP1亚型AQP蛋白。Real-Time PCR检测结果表明,GoAQP基因在根中表达量最高,茎中表达量最少;且受NaCl和PEG胁迫表达上调,NaCl表达呈双峰分布。因此GoAQP基因可能参与了东方山羊豆耐盐性调控。同时成功构建超表达载体pCAMBIA-1302-GoAQP,为转基因验证基因功能创造了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物（重组N蛋白）进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化（如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等）,确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。     

苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆

利用特异引物从基因组BAC文库筛选到1个35 kb的片段,对该片段测序比对分析发现可能含有p26的复制区.为了验证该片段中是否含有p26的复制区,首先,将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304用EcoR I酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后自连,获得复制子克隆载体pHT304E;随后,将12 kbEcoR I片段亚克...