四种转基因玉米新型质粒标准分子协同实验验证

构建了分别适于转基因玉米GA21、TC1507、T25和Bt11品系特异性双重PCR检测标准分子,并对其在定性PCR检测体系中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对7家实验室返回结果的统计分析表明,标准分子pBt11、pTC、pT25和pGA分别对转基因玉米Bt11、TC1507、T25和GA21品系具有高特异性。4个标准分子在zSSⅡb和对应品系特异性序列单一PCR检测体系中检测下限均为50拷贝。因此,4个标准分子均可作为新型标准物质用于相应转基因玉米品系特异性定性检测。     

转基因油菜Ms8质粒分子的制备

随着转基因产品的大规模商业化和我国大规模进口油菜籽,有效管控存在的风险显得非常必要和有意义,试验研究了质粒标准分子pMs8的研制过程,包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、均匀性检验、稳定性考察、定值。结果表明,该质粒分子标准物质的内源基因和外源基因的均匀性良好,没有扩增出所选的其他特异性基因,短期稳定性在14 d(处理温度大于25℃)发生显著变化,长期稳定性大于6个月,两种方法对外源基因拷贝数的定值结果相近,因此,p Ms8是有准确量值的质粒标准分子。可替代性研究结果表明,其可替代基因组作为转基因油菜Ms8定量的阳性标准。     

转基因康乃馨Moonlite品系检测用质粒标准样品研制

截至2020年底,国际上已有19种转基因康乃馨品系进入商业化种植。为了实现转基因康乃馨的有效检测监管,研制检测标准样品十分必要。目前,国际上还没有该类标准品的相关报道。为此,本文研制了商业化时间最长、种植量较大的转基因康乃馨Moonlite品系质粒标准样品,使其与转基因康乃馨检测技术标准的应用相配套,为口岸转基因产品的检测监管提供必要的技术支撑。首先,将康乃馨内源ANS基因1 279 bp片段和转基因康乃馨Moonlite品系406 bp 5'端特异性序列分别插入到pcDNA3.0载体的酶切位点和距离1 kb以上的多克隆位点上,合成质粒DNA标准样品。后将质粒DNA标准样品进行稀释、分装,对其均匀性、最小取样量和短期、长期稳定性等进行测定,采用数字PCR方法对质粒DNA标准样品进行定值,并进行不确定度评估。质粒DNA标准样品pLite经全基因组测序,与公开发布的序列完全一致。均匀性实验结果表明,分别以ANS基因和Moonlite品系特异性序列为目标进行测定,F值分别为1.61和1.14,均小于95%置信区间的F值,质粒DNA标准样品足够均匀。质粒DNA标准样品的最小取样量为2 μL。稳定性实验结果表明,质粒DNA标准样品pLite在45 ℃高温条件下,可稳定保存14 d;在26 ℃及以下温度条件下,可稳定保存1个月,在4 ℃及以下温度可稳定保存6个月,说明质粒DNA标准样品适宜运输。质粒DNA标准样品在反复冻融25次后,拷贝数浓度无显著变化。定值结果表明,质粒DNA标准样品pLite中康乃馨内源ANS基因拷贝数的参考值为(6.13±0.22)×10⁶ μL^-1,Moonlite品系特异性序列拷贝数的参考值为(6.10±0.24)×10⁶ μL^-1。研制的质粒DNA标准样品pLite具有良好的均匀性和稳定性,获得国家标准样品证书后,可用于转基因康乃馨Moonlite品系的检测。     

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础，是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料，其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料，对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测，按质量分数(以干基计)称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1 000.0 mg·g^-1的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检，初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR(ddPCR)方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON8742...     

转基因玉米NK603转化体/zSSIIb内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR（dPCR）方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR（ddPCR）的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSIIb PCR方法组合,建立NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSIIb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol·L^-1/200 nmol·L^-1,在60℃退火延伸。NK603/zSSIIb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10—60 000 copies DNA。应用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25%;dPCR定量结果与荧光定量PCR（qPCR）定量结果无显著差异,且具有更高的精确性。【结论】内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性。以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质。     

转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果为0.910,扩展标准不确定度(K=2)为0.013。     

转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910,扩展标准不确定度（K=2）为0.013。     

用于检测转基因作物中调控元件的质粒标准分子的构建

为解决转基因农产品检测中阳性标准物质匮乏的问题,利用重叠PCR技术将检测过程中常用的调控元件Ca MV35S启动子、FMV35S启动子、PAT29启动子、Ubiquitin启动子、NOS启动子、35S终止子、NOS终止子和E9终止子依次连接获得融合片段,再利用分子克隆技术将融合片段转化到载体p MD-19T中,获得含有调控元件的标准质粒p MD-RG。PCR和测序结果验证了标准分子构建的正确性,并且标准质粒的均匀性和稳定性比较好,符合标准物质候选物的要求,可代替阳性标准物质用于转基因成分的检测和研究。该质粒可用于大多数已经批准的转基因作物的检测和监管工作中。     

运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系的研究

[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。     

利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米

建立了一种可同时检测9种转基因玉米(Zea mays L.)的可视化膜芯片检测方法。该方法利用紫外交联技术,将9种转基因玉米特异性探针及内源性玉米醇溶蛋白基因(Zein)探针和杂交质控探针固定于尼龙膜表面制成检测芯片。通过多重PCR同时扩增多重靶标片段,生物素化产物与检测芯片杂交。阳性结果由链酶亲和素-碱性磷酸酶及显色底物NBT/BCIP的显色反应在芯片表面形成裸眼可见的点。应用商业化转基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、转基因棉花(MON1445、MON15985)、转基因大豆及非转基因材料检验了芯片的性能,结果表明,制备的检测芯片具有良好的特异性和重复性,检测限为0.5%。芯片鉴定结果与PCR产物测序结果一致。     

苹果茎沟病毒CP基因质粒标准样品的研制

本研究通过扩增苹果茎沟病毒CP基因,经克隆测序后制备了ASGV核酸标准样品,分装后进行均匀性和稳定性检验,并联合外部实验室对标准样品进行定值。结果表明,制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求,可用于苹果茎沟病毒核酸检测的标准质控品。     

除草剂混合标准溶液中标准物质稳定性研究

选取德国DR公司生产的28种除草剂标准物质,将其配制成混合标准溶液后转移至20 mL带聚四氟乙烯衬盖的棕色螺口样品瓶中,于-18℃避光贮存,采用液相色谱串联质谱法测试各组分量值随贮存时间的变化。结果表明:在90天内,标准物质各组分量值的标准偏差在12~73μg/L范围内,最大相对标准偏差为3.04%(n=5),测量结果的相对不确定度小于5.60%。在置信度为95%时,标准物质各组分量值在(1 000±113)μg/L范围内,测量的偏差不显著。在不超过标准物质的有效期内,稀释混合分装后的标准物质可保存90天。     

虾油和蟹油的理化特性研究

[目的]研究以螃蟹壳和虾头为原料提取的蟹油和虾油的理化特性。[方法]在常温和煎炸条件下,测定比较芝麻香油、豆油、虾油和蟹油的酸值、碘值和过氧化值,并对4种油的外观变化进行分析。[结果]试验表明,虾油和螃蟹油在常温下新鲜度高,在煎炸条件下氧化稳定性比豆油和芝麻香油稍差,且在煎炸40min后失去特征优势;在感官评价中,虾油和螃蟹油综合得分较高,但在油炸条件下优势不明显。[结论]研究可为虾油和蟹油的综合开发利用提供参考依据。     

糯玉米萌发期耐低温品种资源的综合评价

为构建不同糯玉米品种萌发期耐低温评价体系，以48个糯玉米品种为试验材料，测定低温胁迫下糯玉米的10个萌发及生长指标，通过主成分分析法、隶属函数法、聚类分析和回归分析，对糯玉米品种耐低温性进行综合评价与分类。结果表明，主成分分析将10个测定指标转化为根系生长因子和种子萌发因子2个相互独立的综合指标，建立了糯玉米耐低温综合得分模型Y=0.647 7Y₁+0.144 2Y₂（其中，Y₁、Y₂为2个主成分，Y₁代表的主要指标包括相对根干重、相对根表面积、相对根体积、相对根长，反映低温胁迫下糯玉米根系生长的状态；Y₂代表的主要指标包括相对苗干重、相对发芽率、相对活力指数、相对发芽势，反映低温胁迫下糯玉米的萌发情况）。通过隶属函数法对48个糯玉米品种的耐低温能力进行排序，筛选出5个耐低温能力较强的品种，依次为‘润彩糯686’‘景坡82’‘润糯175’‘润糯605’和‘天贵糯932’。聚类分析将48个糯玉米品种划分成4个类群。回归分析表明，相对根干重、相对苗长、相对发芽势、相对发芽率、相对苗干重和相对根表面积可作为糯玉米耐低温评价的重要指标。多方法关联分析的综合评价方法可对不同耐低温能力的糯玉米品种进行有效筛选分类，为糯玉米耐低温评价及耐低温种质资源的筛选提供参考。