产纳豆激酶之菌种的分离与培养

纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）是从日本传统食品纳豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶．从市售纳豆中分离出一株能产ＮＫ的菌株，经鉴定为枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，其液体培养生长曲线呈Ｓ形，６～４８ ｈ 为指数生长期，４８～９６ ｈ 为稳定生长期；产酶高峰期为稳定生长前期；大豆渣、豆浆、大豆蛋白胨及胰蛋白胨４ 种氮源中以大豆蛋白胨的产酶量最高，最高产酶量为６１０．７ 尿激酶单位／ｍ Ｌ 发酵液．     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取激酶、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶性质进行研究,结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选

分别从北京、大连和日本三个产地的纳豆食品中分离纯化得到了9个具有纳豆芽孢杆菌典型菌落特征的芽孢杆菌单菌落,与模式菌株纳豆芽孢杆菌N1株分别从菌落形态、个体形态和生理生化试验三方面进行对比鉴定,结果表明,其中5株芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌。将这5株纳豆芽孢杆菌分别在酪素平板上划线初选,得到了298株具有蛋白酶活力的菌株,从中筛选出活性最高的5株命名为:NB、NC、ND、NE和NF,测定各株发酵液的纳豆激酶酶活力,结果表明NB、NC和ND3株具有较高纳豆激酶活性,酶活力分别达到了1041.37、1125.13和1804.64IU·mL-1。     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

利用单因素及正交试验,对纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)液体发酵生产纳豆激酶(Nattokinase,NK)的培养基组成(碳氮比和离子组成)和培养条件(温度、pH值、发酵时间、接种量和装液量等)对产酶量的影响进行了研究。结果表明,最佳发酵培养基组成及发酵条件分别为:可溶性淀粉2.0%,大豆蛋白胨1.5%,Na2HPO4·12H2O0.4%,KH2PO40.2%,MgSO4·7H2O0.075%,CaCl20.01%,培养温度37℃,pH值7.0,发酵时间24h,转速180r/min,种龄16h,接种量3%,装液量25mL/250mL。在优化发酵条件基础上,进行了5,20L发酵工艺放大的初步研究,在此条件下,摇瓶,5L罐和20L罐发酵酶活最高分别达到915,1086,946IU/mL。     

纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究

从5种不同样品中分离得到30株菌株,通过初筛和复筛,筛选出1株纳豆激酶高产菌株T-3,其产酶活性可达到3158.97IU/mL,并对菌株的个体形态、菌落形态和生理生化特征进行了鉴定,确认菌株T-3属于枯草芽孢杆菌属。该菌株对温度、pH值和胆盐具有较好的耐受性,并且具有良好的传代稳定性。     

海参液态发酵制备枯草杆菌蛋白酶的研究

以优化的纳豆枯草杆菌液态发酵条件为基础,海参为培养基液态发酵生产枯草杆菌蛋白酶。试验结果表明:发酵12 h时菌体生长达到最高峰,12~80 h为稳定期,80 h后为衰亡期;通过纤溶酶活力测定发现,发酵产酶活力最高时间为3 d,酶活力高达245.75 IU/m l,菌体生长时间与酶活力相关;发酵前后发酵液中总糖和蛋白质的浓度均有减少且与菌体生长情况相对应,说明发酵过程中菌体利用发酵液中的糖、蛋白质作为营养物质生长,而氨基酸的含量相对增加。     

模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究

利用模拟移动床从纳豆激酶发酵液中分离纯化纳豆激酶,通过单柱试验计算出模拟移动床的分区方式及初始参数,利用正交试验方法优化参数,最终所得纳豆激酶的纯度为90%,收率为85%,活性为(8 000±50)IU/mg。     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。     

纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析

设计引物进行PCR反应,从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增和克隆纳豆激酶基因.序列分析表明,所克隆的纳豆激酶基因序列全长1 473 bp,其中阅读框架1 143 bp,阅读框架以GTG为起始密码子,编码包括信号肽、前导肽、成熟肽在内的381个氨基酸;表达产物为前纳豆激酶原,其中N端29个氨基酸组成信号肽,随后的77个氨基酸组成前导肽,最后的275个氨基酸组成成熟肽.     

纳豆发酵原料和工艺技术研究

选取各品种大豆制作纳豆,通过试验结果得知,以黄小豆为原料时,纳豆品质较好。在以黄小豆为原料的基础上,通过正交试验得到适宜的发酵条件:接种量2%,发酵温度37℃,发酵时间为18 h,纳豆激酶酶活达1 725.68 U/g。