神经型一氧化氮合酶在大菱鲆脑组织中的分布及定位

[目的]探明神经型一氧化氮合酶(nNOS)在大菱鲆(Scophthalmus maximus)脑组织中的分布情况,为揭示大菱鲆脑组织中一氧化氮(N0)的生理功能提供形态学资料.[方法]分别采用NADPH-d组织化学染色法和免疫组织化学法对大菱鲆脑组织中的nNOS进行定位研究.[结果]NADPH-d组织化学染色结果显示,大菱鲆大脑皮质中有蓝色的神经元和神经纤维存在.神经元呈梭形、锥形等形状,神经纤维呈串珠状且无序交织;小脑中NOS阳性神经元在分子层分布稀疏,在颗粒层分布密集,浦肯野细胞胞核淡染.经免疫组织化学法染色后,可观察到大脑皮质中nNOS免疫组化反应阳性物质呈深棕色;小脑皮质的分子层、颗粒层及浦肯野细胞层均有nNOS阳性神经元分布,浦肯野细胞呈免疫组织化学阳性反应.[结论]大菱鲆脑组织中的NOS类型主要限于nNOS,且nNOS在神经活动中发挥重要作用,也进一步证实N0在不同物种中具有一些共同的作用,但不同物种或相同物种不同组织中NO分布及含量存在差异.     

兔脑nNOS阳性神经元的形态、结构和分布规律

利用SABC免疫组织化学方法，对兔脑神经型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元的形态、结构及分布规律进行了系统研究，结果表明：① nNOS阳性神经元呈深棕色，着色主要在胞质内，细胞核处较为浅淡；神经元胞体形态多种多样，有三角形、圆形、椭圆形、梭形等，神经元突起有一个或者数个；nNOS阳性神经纤维大多呈棕色串珠样，有些区域的阳性纤维交错分布，相互交织成网状。②家兔的各个脑区均有nNOS阳性神经元和神经纤维出现,其中在大脑皮质、小脑、丘脑下部、中脑和脑桥广泛分布，延髓分布极少。③nNOS阳性神经元，在仔兔时就已基本发育到成年兔水平，以后随着年龄增长逐渐发育成熟至衰老，到2岁龄（老年兔）时就出现了显著的衰老变化，即密度减小，表达强度减弱，第一级突起数减少，最长突起长度变短等。结果提示：nNOS阳性神经元及其催化产生的NO在家兔神经系统的发育和神经调控中起重要作用。     

nNOS阳性神经元在兔大脑皮质和小脑皮质的分布

利用SABC免疫组织化学方法,对各年龄段家兔大、小脑皮质nNOS阳性神经元的分布和形态结构进行了研究。结果显示:nNOS阳性神经元主要分布在大脑皮质的Ⅱ~Ⅳ层,小脑皮质的颗粒层;nNOS阳性神经元呈深棕色,细胞质明显,细胞核着色较淡,胞体形态多样,有三角形、圆形、椭圆形、梭形等,突起有一个或者数个;阳性神经纤维大多呈棕色串珠样,有些区域的阳性纤维交错分布,相互交织成网状;在大、小脑皮质,阳性神经元密度随年龄增长而逐渐减小,分布变得稀疏,而胞体直径却逐渐增大。由此得出:家兔大脑皮质和小脑皮质内有丰富的nNOS阳性神经元分布,神经元密度随年龄增长逐渐减小,胞体直径逐渐增大;nNOS阳性神经元及其催化产生的NO在家兔中枢神经系统发育和神经调控中起重要作用。     

Protective effects of Zhouluotong extract Z-6 on Schwann cells damaged by high-glucose and PI3K/Akt/nNOS pathway

AIM:To explore the role of PI3K/Akt/nNOS in Zhouluotong extract resisting diabetic peripheral neuropathy. METHODS:The Schwann cells were divided into normal group (D-glucose 25 mmol/L), model group (D-glucose 100 mmol/L), Zhouluotong extract Z-6 + high glucose group, Zhouluotong + high glucose group, mecobalamine + high glucose group. The viability, nitric oxide content and the Ca2+-ATPase activity in Schwann cells were determined by Cell Counting Kit-8 , nitric oxide assay kit and Ca2+-ATPase assay kit, respectively. The apoptosis of Schwann cells were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bak and caspase-3, and the phosphorylation levels of nNOS and Akt were determined by Western blotting. The signal pathway of PI3K/Akt was explored by dominant negative PI3K and Akt (δp85 and DN-Akt) transient transfection assay. RESULTS:Under high-glucose culture, the cell viability, nitric oxide content in culture supernatant, the expression of Bcl-2 and Bcl-xL, and the phosphorylation levels of Akt and nNOS in the Schwann cells were significantly increased. The cell apoptosis, the expression of Bax, Bak and caspase 3 in the Schwann cells were significantly decreased by Zhouluotong extract Z-6, compared with model group. Increased nitric oxide content and the up-regulation of nNOS were observed. However, the effects of blocking PI3K/Akt, the upstream pathway of nNOS , by transfection with DN-δp85 on Akt phosphorylation in the Schwann cells was still unclear. CONCLUSION: Zhouluotong extract Z-6 changes the phosphorylation of nNOS, and the expression of anti-apoptotic factors, caspase-3 and pro-apoptotic factors in Schwann cells under high-glucose culture, thus reducing apoptosis and elevating viability. The relationship to PI3K/Akt/nNOS pathway needs further investigation.     

运输应激对大鼠行为、血清皮质酮及下丘脑视上核nNOS表达的影响

为研究运输应激对动物行为、内分泌以及脑内神经型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)表达的影响,采用摇床加制动束缚模拟公路运输途中的摇晃、拥挤和限制活动等因素,建立大鼠运输应激模型(35℃,120r/min,应激2h)。将18只大鼠随机分为对照组、应激组和应激恢复组,采用旷场试验评定大鼠行为反应,放免法测定大鼠血清皮质酮含量,免疫组化法检测大鼠下丘脑视上核(Supraoptic nucleus,SON)中nNOS的表达。结果显示,与对照组相比,应激组大鼠的自主活动明显减少(P0.01),血清皮质酮(Corticosterone,CORT)含量显著增加(P0.01),SON中nNOS的平均光密度值显著上升(P0.01),应激恢复组大鼠的自主活动次数和血清皮质酮含量恢复至正常水平,而SON中nNOS的平均光密度值进一步上升。上述结果表明,运输应激对大鼠情绪、行为和神经内分泌有显著影响,24h后行为及内分泌状况改善,而神经递质的改变则需更长时间恢复。     

Elevated expression of CAPON and neuronal nitric oxide synthase in the sciatic nerve of rats following constriction injury

Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) has been implicated in peripheral nerve lesions and regeneration. The CAPON adaptor protein interacts with the PDZ domain of nNOS, helping to regulate nNOS activity at post-synaptic sites in neurones, but it is not known whether its expression is altered in sciatic nerves after chronic nerve constriction injury. In the present study, the spatiotemporal expression of CAPON was determined in chronically constricted rat sciatic nerves. Similar to the level of protein expression, CAPON mRNA was significantly up-regulated for almost 5 weeks following sciatic nerve injury. Immunohistochemistry demonstrated that increased CAPON was found mainly in S-100-positive Schwann cells. In addition, co-immunoprecipitation demonstrated an interaction between CAPON and nNOS in Schwann cells and the interaction was enhanced in injured sciatic nerves. CAPON may be involved in peripheral nerve regeneration through regulation of nNOS activity.     

小鼠髓过氧化物酶(MPO)基因克隆分析及真核表达载体的构建

髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一种血红素辅基蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一,参与多种疾病的发生和发展过程。本研究旨在克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,检测该基因在小鼠神经细胞的表达谱。首先利用RT-PCR法与克隆载体克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,对其进行生物信息学分析;然后构建真核表达载体pEGFP-C1-MPO,瞬时转染小鼠神经元细胞,通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测MPO在神经细胞的表达及分布规律。结果显示,小鼠MPO基因CDS全长2171 bp,编码718个氨基酸,与章鱼、美洲灰熊、马、人、非洲爪蟾、扬子鳄等物种的氨基酸序列同源性均高于79.25%。转染细胞后,试验组MPO的mRNA和蛋白表达水平极显著高于阴性对照组(P<0.01),表明小鼠MPO基因的真核表达载体pEGFP-C1-MPO构建及转染成功;免疫荧光结果显示MPO蛋白主要分布于神经元细胞质中。过表达MPO后,nNOS的mRNA水平显著高于对照组(P<0.05),而NADPH表达水平显著低于对照组(P<0.05)。总之,在体外过表达MPO可促进nNOS表达,抑制NADPH的表达,这为今后深入研究MPO的功能奠定理论基础。     

兔脑nNOS阳性神经元的形态、结构和分布规律

利用SABC免疫组织化学方法，对兔脑神经型一氧化氮合酶（nNOS）阳性神经元的形态、结构及分布规律进行了系统研究，结果表明：①nNOS阳性神经元呈深棕色，着色主要在胞质内，细胞核处较为浅淡；神经元胞体形态多种多样，有三角形、圆形、椭圆形、梭形等，神经元突起有一个或者数个；nNOS阳性神经纤维大多呈棕色串珠样，有些区域的阳性纤维交错分布，相互交织成网状。②家兔的各个脑区均有nNOS阳性神经元和神经纤维出现，其中在大脑皮质、小脑、丘脑下部、中脑和脑桥广泛分布，延髓分布极少。③nNOS阳性神经元，在仔兔时就已基本发育到成年兔水平，以后随着年龄增长逐渐发育成熟至衰老，到2岁龄（老年兔）时就出现了显著的衰老变化，即密度减小，表达强度减弱，第一级突起数减少，最长突起长度变短等。结果提示：nNOS阳性神经元及其催化产生的NO在家兔中枢神经系统的发育和神经调控中起重要作用。