鸡新城疫、产蛋下降综合症病毒血凝抑制试验抗原的研制

新城疫病毒（ＮＤＶ）鸡胚尿囊液和产蛋下降综合症病毒（ＥＤＳＶ）鸭胚尿囊液在不同保护剂和保存条件下血凝（ＨＡ）试验结果表明，以１０％甘油做保护剂制备的抗原，在－１８℃、４～８℃和常温条件下可保存一年，其ＨＡ效价稳定。抗原制备方法简单，成本低廉，适合基层生产单位使用。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

禽腺病毒贵州分离株ＨＳ—１的核酸酶切分析与蛋白抗原鉴定

本研究利用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗestern-Blotting技术鉴定３株不同的减蛋综合征病毒（贵州株ＨＳ－１、南京分离毒ＧＣ２、国际标准毒ＡＶ－１２７）的蛋白抗原性，结果表明，３株毒的蛋白多肽分子量均在１０６－１２kＤ范围,一各条多肽的组成上略有差异；它们都具有两条相同的免疫原性多肽，分子量分别为１０６和１００ＫＤ。同时，运用ＥcoRⅠ,HindⅢ，ＰｓｔⅠ和ＳmaⅠ等５种限制性内切酶进行了酶切分析，证实３株ＥＤＳ病毒用ＰstⅠ和ＳmsⅠ酶切的片段大小及长度略有不同，而其它３种酶的酶切图谱完全相同。     

减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与真核表达载体的构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,酶切、PCR及测序结果表明插入的片段为目的基因.切下该目的基因定向克隆至pcDNA 3质粒构建六邻体蛋白基因真核表达载体pcDNA 3-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序鉴定,证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的转染、表达及进一步阐明EDSV六邻体基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好的基础.     

一种非EDSV引起的鸭传染性减蛋症

自1999年5月以来，浙江省许多产蛋鸭发生了一种以产蛋率锐减为特征的新疾病，其中某地区67户养鸭专业户，共饲养蛋鸭15.7万羽，陆续进入产蛋高峰期后，有2375 羽鸭群的产蛋率突然下降，由原来的91.2%减到52.7%，同时伴有畸形蛋、沙壳蛋，蛋质低劣，蛋清稀薄，除少部分病鸭伴有烦躁不安和吵棚外，鸭群的精神体态基本正常，采食量略有下降，一般不引起死亡。起初养鸭户都误认为是当地饲料厂供应的饲料所致，后来发现该病具有传染性，疫病主要沿河流自上而下蔓延。在此后1个多月时间内，共有49户养鸭户12.3 万羽蛋鸭相继发病，产蛋率下降幅度为20%～80%，使用各种抗菌药物治疗无效，提高饲料营养也不起作用。该病发病急，传播迅速，通常在2～3天内产蛋率由80%～90%以上下降到30% ～40%，有的甚至更低，产蛋率越高，感染后下降幅度往往越大。病鸭从产蛋下降到康复需3 -7周时间，恢复后不能达到标准产蛋曲线，产蛋周期缩短。剖检病鸭主要表现为生殖器官病变，卵巢卵泡减少、萎缩，输卵管蛋白分泌部缩小，蛋白分泌腺减少，子宫萎缩，有的严重病例可见卵黄性腹膜炎，肝、心、肾和肺有斑点出血。该病的临床症状类似于减蛋综合征（ EDS）［1］，但是，用减蛋综合征灭活苗免疫预防不能有效保护。作者对病鸭体作无菌检查并分离了病毒（命名为YH99株），用0.2 μm滤器过滤后，经人工感染易感蛋鸭能成功诱导典型发病，再从病鸭中回收到同样病毒。将YH99株与鸡源减蛋综合征病毒（EDSV-AV127）［2～4］和鸭源减蛋综合征病毒［3］（EDSV-JE 1，由上海市畜牧兽医站周锦萍提供）进行比较，结果发现：     

鸡减蛋综合征病毒DNA结合蛋白的基因结构及同源分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。     

减蛋综合征病毒纤维蛋白主要抗原结构域原核表达及抗原性鉴定

利用生物信息学软件对减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127纤维蛋白进行抗原特性分析,人工合成融合基因Knobs,将其克隆到原核表达载体pET28a的多克隆位点,构建原核表达载体pET28a-Knobs,将其转化到感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS中,经30℃、1.0 mmol.L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示:目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为26.0 ku;Western blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。本试验为进一步研究EDSV抗原结构域的免疫原性以及减蛋综合征基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

鸡源和鸭源EDS病毒的某些生物学特性比较

对 Ｅ Ｄ Ｓ 病毒鸡源株 （ Ｎ Ｅ４） 和鸭源株 （ Ｊ Ｅ１） 在繁殖动态、毒价、免疫原性、核酸酶切图谱、多肽组成等５ 个方面进行比较研究。结果表明, ２ 株相同血清型、不同宿主来源的 Ｅ Ｄ Ｓ 病毒在普通生物学特性方面基本相同, 但在核酸酶切图谱和多肽组成等分子生物学水平上存在明显差异。     

鸡源和鸭源EDSV某些分子生物学特性的比较

采用差速高心法纯化鸡源（NE_4株）和鸭源（JE_1株）EDSV后,一方面用酚—氯仿抽提法分别提取两种毒株的核酸,选取EcoR、BamH、I、Bgl I、Bgl、Ⅱ、Kpn、I、Pst I和Hind Ⅲ 7种限制性内切酶对两种毒株的核酸进行酶切图谱分析;另一方面利用SDS—PAGE技术对两种毒株进行多肽分析。酶切结果显示:鸡源株用上述7种酶酶切后分别产生4、4、6、8、5、9、10个片段,共计46个;鸭源株分别产生4、4、5、7、9、10、8个片段,共计47个。两者的酶切结果除EcoR I 的酶切片段数和酶切图形完全相同外其余均存在不同程度的差异。凝胶染色及染色凝胶扫描结果均显示:NE_4株有13条多肽,JE_1株有16条多肽,其中有8条多肽的分子量两者相同。Western Blotting结果显示:NE_4株和JE_1株均有 8条具有免疫原性的多肽,其中2条分子量两者差异明显,其余6条分子量相同。     

鸡减蛋综合征病毒分离株AA－2基因组Hind Ⅲ酶切部分片段的分子克隆

以非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经差速离心法纯化，电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量约３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。ＨｉｎｄⅢ酶切ＥＤＳＶＤＮＡ可见１０条片段，以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法对病毒基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段进行分子克隆，获得１７个重组质粒，通过酶切、斑点杂交鉴定，证实已经成功地克隆到ＥＤＳＶ的５．２４ｋｂ、２．０２ｋｂ、１．６５ｋｂ、１．４７ｋｂ、１．４１ｋｂ等５个ＤＮＡ片段。