间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体

ＡＥＶＶａｎＲｏｅｋｅｌ鸡胚适应株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和鸡胚神经胶质细胞（ＣＥＢ）传代,用盲传至第６代的ＣＥＦ、ＣＥＢ制成荧光标本。建立了ＡＥＶ荧光抗体检测方法,确定了待检血清稀释度１∶１０和荧光抗体ＦＩＴＣ羊抗鸡ＩｇＧ的稀释度１∶１０的工作浓度。通过对ＮＤＶ、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＡＩＶ、Ｒｅｏ等标准阳性血清的交叉试验,证实该法特异性强,且简单、方便、经济,适合于鸡群ＡＥＶ抗体的检测。     

一种优化鸡胚成纤维细胞制备方法及生长曲线测定

鸡胚成纤维细胞（CEF）的来源方便,制备简单,耐受性好,且适合于许多病毒的生长繁殖,因此被广泛用于疫苗的生产、病毒的培养以及一些细胞和分子生物学的研究。然而传统的鸡胚成纤维细胞制备方法存在制备时间长、死细胞较多和细胞贴壁慢的问题。笔者根据经验摸索出一种实验室快速制备CEF的简便方法,并通过台盼蓝染色用细胞计数法绘制了原代CEF及次代CEF的生长曲线。该简便方法的建立为实验室快速制备高质量高纯度的鸡胚成纤维细胞提供了方便,同时对其生长曲线的测定也为进行基因转染方面的研究积累了资料。     

3种细胞培养流感病毒的比较

将流感病毒分别接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)、Vero和MDCK细胞,并改变细胞维持液中FBS浓度,然后检测胰酶的用量、细胞培养流感病毒的最佳时间、细胞接种病毒最佳吸附时间和接种剂量、收获细胞液后的血凝素(HA)滴度.结果表明,胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用;加入约4 μg/mL的胰酶可提高病毒产量.最佳收获时间为60 h～72 h,吸附时间为90 min,接种剂量为0.1 mL/L;CEF、MDCK细胞上病毒HA滴度高于Vero细胞.     

Screening for Monoclonal Antibodies Against the Membrane Proteins of Chicken Embryo Fibroblast Blocking the Infection of IBDV

This article aims to establish an efficient assay for screening monoclonal antibodies （McAbs） against the membrane proteins of chicken embryo fibroblast （CEF） for further studies of the cellular receptors of infectious bursal disease virus （IBDV）. McAbs against the membrane proteins of CEF were prepared by cell fusion. The monolayer CEF pre-incubated with the CEF-specific McAbs for 2 h were infected with IBDV and incubated with F22-EA6-biotin postinfection. Then, the cells were reacted with streptavidin-horseradish peroxidase （HRP） and finally stained by 3-amino-9-ethylcarbazole （AEC）. The inhibitive percentage of IBDV infection was calculated by counting the IBDV-infected cells to determine the inhibition efficiency of the CEF-specific McAbs. Compared with the control cells, the IBDV-infected cells pretreated with CEF-specific antibody significantly decreased; supernatant fluids of a total of 768 hybridomas were analyzed. The results of immunohistochemistry assays showed that six of them （1A5, 1H11, 2B 12, 3G1, 4D10, and 4B8） have the abilities to block the infection of IBDV to CEF, among which 4B8 can perfectly block the infection. This novel method is a sensitive and specific assay for the screening of CEF membrane protein-specific McAbs, which can block the infection of IBDV to CEF, and these McAbs can be used for the further investigations of the cellular receptors of IBDV.     

中药免疫调节剂体外细胞毒性测定

采用形态学观察和MTT两种方法,测试了中药免疫调节剂(TJJ)在鸡胚成纤维细胞(CEF)和小鼠纤维母细胞(L929)体外培养中的最大安全浓度。结果表明:⑴TJJ的细胞毒性很低,对CEF和L929的最大无毒浓度分别达3.12g/L和1.56g/L;⑵两种细胞比较,L929对药物毒性的反应性较CEF更敏感;⑶两种方法比较,MTT法更灵敏、更客观;⑷在同一种细胞的不同生长状态下(形成单层前后)加入TJJ,药物对细胞的毒性结果无变化,说明药物对细胞的毒性与细胞种类有关,而与细胞的生长状态关系不明显。     

中性红染色法检测人参皂苷及其衍生物对CEF增殖的影响

[目的]为体外研制人参皂苷及其衍生物的抗MDV作用机制提供理论依据.[方法]分别吸取各试验药物(人参皂苷、人参皂骨衍生物1～8,阳性对照盐酸吗啉胍)溶液0.5 ml至24孔细胞培养板第1孔中,然后1～10孔每孔加入0.5 ml细胞维持液,再将第1孔内液体混匀,吸取0.5 ml至第2孔内,再混匀,吸取0.5 ml至第3孔内,如此反复至第10孔.则药物的稀释倍数分别为21～210.其浓度分别是3.000 mg/ml,1.500 mg/ml,0.750 mg/ml,0.375 mg/ml,187.500μg/ml,93.750μg/ml,46.880μg/ml,23.440 μg/ml,11.720 μg/ml,5.860 μg/ml.采用中性红染料吸收法,检测人参皂苷及其衍生物对鸡胚成纤维细胞(CEF)体外培养中增殖活性的影响.试验中必须结合细胞病变观察法,通过在光镜下观察细胞的CPE,确定进行测定的最佳时间,以保证结果的准确性.具体操作如下:测定前2 h各孔加入50μl中性红染液,测定时倒掉孔内液体,用PBS洗细胞3次,每孔加入200μl脱色液,置微量振荡器上振荡10 min,使结晶溶解.然后用酶联免疫检测仪测定DD570值,作为细胞增殖的指标.OD值与活细胞的增殖呈正比,OD值越大,表明细胞增殖越旺盛.[结果]人参皂苷在大于750μg/ml浓度下对细胞有毒性,在5.86～46.88 μg/ml浓度下对细胞有促增殖作用.毒性作用在72 h下降,而促增殖作用在给药24 h后就表现出来.衍生物1在高浓度的4组均有毒性,OD值显著低于细胞对照组,但衍生物1的促增殖作用不明显.衍生物2在48～72 h分别有5～6组高浓度的OD值显著低于细胞对照组.衍生物3在高于187.5 μg/ml的浓度时,OD值低于细胞对照组,并且在72 h时,有2组OD值(11.72和5.86 μg/ml)高于细胞对照组,表现出促增殖作用.衍生物4的毒性较高,大部分孔的OD值显著低于正常对照组.衍生物5在浓度高于187.5 μg/ml时,OD值低于正常细胞对照组(P＜0.05),在24和72 h,分别有一组的OD值显著大于细胞对照组.衍生物6的毒性较大.衍生物7的促增殖作用较明显,从浓度93.75 μg/ml开始以后的OD值都大于细胞对照组,且在48 h有2组,72 h有3组显著大于细胞对照组.衍生物8在72 h时,低浓度表现出促增殖作用.盐酸吗啉胍没有促增殖作用,3 000 μg/ml浓度下与细胞对照组的OD值差异显著.可见,各药物的促增殖作用不完全相同,低毒性的药物促增殖作用更明显.从药物对CEF细胞的不同作用时间点来看,以72 h的OD值和正常对照的差异最大,在24 h和正常对照组差异不显著.[结论]人参皂苷及其衍生物在中、低浓度能够促进CEF细胞的增殖,且药物作用具有时间依赖性.     

中药复方粗提物对IBDV感染细胞能力的影响

将中药方1、方2、和方3的粗提物与鸡传染性法氏囊病毒以三种顺序（先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、中药和病毒同时加入）加入到培养24h、已长成完整单层的鸡胚成纤维细胞（CEF）上，观察它们对病毒感染细胞能力的影响。结果表明：在细胞安全浓度范围内，方1、方2和方3的粗提物在先于病毒或与病毒同时加入时均能抑制病毒感染，且与浓度与加药方式有关；以补气、清热凉血、滋阴为主的方3优于以补气、清热凉血为主的方1和以补气为主的方2。     

中药成分对传染性法氏囊病毒感染细胞的影响

将黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂甙、人参皂甙等 1 0种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)以 3种顺序加入到培养 2 4h的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。即先加中药后接种病毒、先接种病毒后加中药、中药和病毒同时加入 ,观察细胞病变的程度 ,以评价它们对IBDV感染细胞的影响。结果表明 ,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时 ,多数中药成分处理组在病毒接种后 72h的细胞病变程度明显减轻 ,表明多数中药能抑制病毒感染细胞 ,且有一定的量效和时效关系。     

鸡全胚成纤维细胞在鸡痘细胞活疫苗生产中的应用

采用鸡胚全部组织(全胚法)制备鸡胚成纤维单层细胞和采用鸡胚部分组织(常规法)制备鸡胚成纤维单层细胞生产了鸡痘细胞活疫苗,接毒后均产生大量的感染多核细胞和典型细胞融合性病变(胡椒粒样).鸡胚效价检测表明,鸡痘细胞苗和鸡痘组织苗均可引起鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚或痘斑,但鸡痘细胞苗产生痘斑数量明显高于鸡痘组织苗.鸡体刺种结果表明,鸡痘细胞苗诱发的免疫反应(发痘)好于鸡痘组织苗;与常规法相比,全胚成纤维单层细胞制备方法可提高鸡胚利用率2倍以上.全胚法也可应用于制备其他鸡成纤维细胞疫苗.     

羊软骨II型胶原蛋白对鸡胚成纤维细胞生长的影响

采用体外细胞培养检测自制羊软骨II型胶原蛋白(Type II collagen from sheep,CII)的细胞毒性,将材料与鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast,CEF)共同培养,观察其对生长的影响,确定鸡胚成纤维细胞对羊软骨CII的最大安全浓度,以及在安全浓度范围内有效促进鸡胚成纤维细胞生长的浓度。结果显示,羊软骨CII对鸡胚成纤维细胞的最大安全浓度为400μg/mL,当羊软骨CII浓度在25μg/mL时,可以极显著的促进鸡胚成纤维细胞的生长。