油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生，并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制，本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素，评估转化子质量，并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL，转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃)，浓度为2 × 10^7~8孢子/mL，农杆菌-受体共培养温度为25℃，共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%，单拷贝插入频率为72.7%，转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体，7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体，并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术，从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

辣椒细菌性果实条斑病菌生物学特性及抑菌药剂筛选

研究辣椒细菌性果实条斑病菌的生物学特性,对病原菌进行室内药剂筛选,旨在为田间病害规律研究和病害防治提供依据。采用紫外分光光度计测定病原菌在不同温度、pH、NaCl浓度下的生长速率。采用滤纸片抑菌圈法对病原菌进行室内药剂筛选试验。结果表明,辣椒细菌性果实条斑病菌最适生长温度为28℃,最适pH 7.0,病原菌的耐盐性为12%。18种供试药剂在药剂推荐使用剂量范围内,四霉素、乙蒜素、77%志信、氯溴异氰尿酸4种药剂对病原菌有抑菌效果,对这4种药剂进行毒力测定,结果表明四霉素的毒力较强,EC₅₀值为11.75 mg/L,毒力强于其他3种试剂,四霉素可作为田间防治药剂的首选。     

抗桃树细菌性穿孔病植物内生菌的筛选及其抑菌机制研究

桃树细菌性穿孔病发生普遍，严重制约了桃产业的发展。为研究植物内生菌对桃树细菌性穿孔病病原菌的抑制作用，从健康桃树、博落回、金银花、板栗等健康植物材料中分离筛选出优势拮抗内生菌株，并测定其胞外代谢产物对病原菌细胞膜与细胞壁通透性、纤维素酶活性、胞外多糖(EPS)含量、呼吸代谢、核酸含量的影响。结果表明，分离得到的45株内生菌中，从金银花植株中分离的曲霉属JYY-3菌株抑菌效果最好，其最小抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)分别为50、200 mg/mL。经该菌株胞外代谢产物处理后，桃树细菌穿孔病病原菌核酸泄漏量、AKP活性和电导率显著提高，且浓度越高效果越明显。此外，JYY-3菌株胞外代谢产物能显著降低病原菌纤维素酶活性、EPS含量、DNA和RNA含量，抑制其琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)活性，且浓度越高作用越强，经2.0MIC菌株JYY-3代谢产物处理12 h后，桃树细菌穿孔病病原菌的SDH、MDH活性较对照组分别降低107.644、13.729 U/mg。可见，金银花内生菌株JYY-3对桃树细菌性穿孔病病原菌有显著的抑制作用，可通过抑制纤维素酶活性及EPS合成以...     

稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8的特性分析

 有性生殖在真菌的生活史和进化过程中具有重要作用,而交配型基因是控制有性生殖的关键因子。前期研究发现稻曲病菌(Villosiclava virens)MAT1-2型菌株中包含MAT1-2-1和MAT1-2-8两个交配型基因,但是它们如何调控稻曲病菌有性生殖依然不清楚。本文研究了它们在不同侵染和生长发育时期的表达模式和编码的蛋白结构特性。研究表明MAT1-2-1在侵染不同阶段一直下调表达;而MAT1-2-8在侵染早期(5 dpi)上调表达,在侵染后期下调表达。与营养菌丝阶段比较,MAT1-2-1和MAT1-2-8在有性发育过程菌核形成、菌核萌发、子座原基形成和子座成熟4个阶段的表达量都是下降的,在菌核形成阶段表达量最低。生物信息学分析显示MAT1-2-1和MAT1-2-8具有磷酸化位点,为非分泌蛋白,无明显的跨膜结构域。蛋白同源比对分析表明MAT1-2-1与香柱菌(Epichloë typhina)的MAT1-2-1同源性最高,而MAT1-2-8与绿僵菌(Metarhizium)的MBR_08192蛋白同源性最高。进一步研究发现MAT1-2-1和MAT1-2-8能够互作,并分别主要定位在细胞核和细胞基质中。通过质谱技术鉴定到MAT1-2-1的一些候选互作蛋白,如假定Ran交换因子Prp20/Pim1(KDB12229.1)、假定rRNA处理蛋白Ebp2(KDB12923.1)及组蛋白H1(KDB12711.1)等。因此,以上结果为研究稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8调控有性生殖的生物学功能奠定了基础。     

瓜类细菌性果斑病症状识别与防控

瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上典型的种子传播细菌性病害,主要侵染西瓜、甜瓜等葫芦科作物,具有发病迅速、传播速度快、爆发性强等特点,被列为中国入境检疫性有害生物。目前该病在全球主要分布于美国、澳大利亚、巴西、土耳其、日本、泰国、以色列、伊朗、匈牙利和希腊。中国主要分布在新疆、宁夏、甘肃、河南等省区。一般田块发病率在45%~75%,严重时高达100%,该病的发生严重影响瓜类产业的健康发展。因此,准确识别并采取有效防控技术,对控制该病的大面积发生,具有十分重要的意义。     

香蕉条斑病毒ORF Ⅰ基因克隆及编码蛋白和同源物的生物信息学分析

【目的】探明杆状DNA病毒属病毒的ORFⅠ基因功能。【方法】本研究从香蕉条斑病毒云南分离株(BSV-YN)中克隆了BSV ORFⅠ基因,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN的分类地位;对其编码蛋白及同源物的理化性质、氨基酸序列组成、亲疏水性、跨膜区域、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点、同源结构域、蛋白二级和三级结构等进行预测和分析。【结果】BSV ORFⅠ基因片段大小为528 bp,编码175个氨基酸,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN属于BSGFV种。生物信息学分析表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白都是不稳定的、亲水性蛋白,以丝氨酸和苏氨酸磷酸化为主。这些蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,无信号肽或跨膜区域。亚细胞定位预测表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白主要在细胞核分布,推测它们在病毒感染的宿主细胞核中发挥重要作用。【结论】推测BSV-YN ORFⅠ在病毒感染的宿主细胞核中参与病毒复制、转录等相关过程。本研究为进一步开展该蛋白的功能研究提供科学线索。     

稻曲病菌致病机制研究进展

 稻曲病是一种水稻穗部病害,在世界各水稻主产区均有发生,已成为世界性病害,在我国也属于水稻主要病害之一。稻曲病的发生严重影响水稻产量和稻米品质。研究其病原菌致病机制,对找寻防治药物的特异性靶标具有重要作用,可为抗病分子育种提供新的思路,为稻曲病菌防治药剂研发提供新的靶标。本文综述了稻曲病菌侵染过程、致病相关基因功能研究、水稻响应稻曲病菌侵染等方面的研究进展,提出进一步研究的策略。现有研究表明,稻曲病菌能成功侵染水稻孕穗期雄蕊的花丝引起发病。病原菌可通过抑制多个水稻免疫途径实现成功侵染;还可模仿胚珠受精激活水稻灌浆、糖代谢等途径为稻曲球的形成提供营养物质;全基因组测序完成和基因编辑技术在基因敲除中的成功应用,为稻曲病菌功能基因研究提供了很好的基础。稻曲病菌独特的侵染过程和营养利用机制是未来研究的重要方向。     

苹果炭疽叶枯病菌对3种杀菌剂的敏感性分析

【目的】了解我国苹果主产区苹果炭疽叶枯病菌(Colletotrichum gloeosporioides)对苯并咪唑类、甾醇脱甲基抑制剂类和咪唑类杀菌剂敏感性的现状,旨为苹果炭疽叶枯病的科学防治提供参考,以及为苹果炭疽叶枯病菌抗药分子机制研究提供理论依据。【方法】采用区分剂量法和菌丝生长速率法,对采自于我国苹果主产区的117个苹果炭疽叶枯病菌菌株进行甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺的敏感性测定,并对随机抽测的28个菌株的β-微管蛋白基因(β-tubulin)进行序列分析。【结果】117个供试菌株对甲基硫菌灵的抗药性频率为100%,均为高水平抗性菌株(HR)。随机抽测24个菌株的β-tubulin基因,其中23个菌株的β-tubulin蛋白第198位氨基酸从谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala),另外1个菌株ZG4-7的第200位氨基酸从苯丙氨酸(Phe)突变成酪氨酸(Tyr)。苹果炭疽叶枯病菌对戊唑醇的敏感性检测结果表明,戊唑醇对供试菌株的EC_(50)值(ρ,后同)为0~0.843 0 mg·L~(-1),平均EC_(50)值为0.155 5 mg·L~(-1),75.21%的菌株对戊唑醇表现出低水平抗药性,设置质量浓度为5 mg·L~(-1)时,对供试群体的平均抑制率为92.72%。苹果炭疽叶枯病菌供试群体对咪鲜胺的敏感性较强,平均EC_(50)值为0.011 9 mg·L~(-1),设置质量浓度为0.5 mg·L~(-1)时,咪鲜胺对供试群体的平均抑制率为95.02%。【结论】苹果炭疽叶枯病菌对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵表现出高抗性;对DMIs类杀菌剂戊唑醇表现出低水平抗性,但已产生高水平抗性菌株;对咪唑类药剂咪鲜胺敏感性较强。     

白叶枯病菌效应子XopN在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用

【目的】黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins, Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,通过细菌Ⅲ型分泌系统分泌到细菌细胞外部,然后转入植物细胞而发挥病理作用。水稻黄单胞菌水稻致病变种即水稻白叶枯病菌的标准菌株PXO99^A分泌的XopN是一种毒性效应子,通过影响寄主免疫反应而使水稻发病。但是,XopN对病菌毒性的影响是否因水稻品种的不同而异,还有待研究。【方法】利用同源双交换技术,先敲除了PXO99^A的XopN基因,获得了∆XopN突变体,又经过遗传互补,得到了回补菌株∆XopN/XopN。通过营养肉汤液体培养,测定了XopN对病菌繁殖能力的影响;根据文献选用14个水稻品种,通过接种实验,测定了PXO99^A对这些品种的毒性与XopN敲除或回补的影响;在XopN发挥毒性作用的水稻品种上,测定了隐性抗病基因OsSWEET11/xa13与显性感病基因OsSWEET11/Xa13受病菌侵染而表达的情况,分析了XopN敲除或回补的影响。【结果】在营养肉汤液体培养过程中,病菌突变体菌株∆XopN的繁殖速度明显低于野生型PXO99^A。PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN接种水稻后,根据其在水稻叶片组织内的繁殖量及随后产生的白叶枯病症状的严重程度,将供试的14个水稻品种分为两种情况。一是感病程度与病菌XopN是否敲除或回补无关,这有10个水稻品种（IRBB1、IRBB3、IRBB8、IRBB10、IRBB14、IR24、IRBB203、IRBB204、IRBB205和IRBB211）,PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN对它们的毒性无明显差别。二是XopN对病菌毒性发挥作用的水稻品种,包括高度感病的3个品种（IRBB208、Asominori和日本晴）和低感品种IRBB13。与PXO99^A或∆XopN/XopN相比,∆XopN对这4个水稻品种的毒性大为降低。在IRBB13上,病菌侵染对隐性抗病基因OsSWEET11/xa13在叶片内的表达发生抑制作用,这一效应与XopN的毒性功能相关。相反,日本晴显性感病基因OsSWEET11/Xa13却受病菌侵染的诱导,在叶片内的表达水平大幅度提高。IRBB208和Asominori携带OsSWEET11/Xa13同源基因,该同源基因在叶片内的表达水平也因病菌侵染而大幅提高。在这4个水稻品种上,PXO99^A和∆XopN/XopN能够诱导OsSWEET11/Xa13或其同源基因表达,但∆XopN无此作用。另外,XopN对病菌在非寄主植物烟草上诱发过敏反应有量变贡献,相比PXO99^A或∆XopN/XopN,∆XopN引起过敏反应的程度有所降低。【结论】XopN是一个有限广谱性效应子,在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用。XopN也是病菌繁殖所需要的,对病菌在非寄主植物上诱导过敏反应有一定贡献。