大肠杆菌 otsB基因的克隆与转化本生烟草的初步研究

海藻糖是一种非还原糖类,可作为渗透调节剂,提高生物在非生物胁迫条件下的抗逆能力.6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP)是海藻糖生物合成中的重要酶类,在大肠杆菌中,otsB基因编码TPP.以大肠杆菌的基因组DNA为模板,通过菌落PCR技术克隆得到otsB基因.将目的基因和p2300-GFP相连,从而构建p2300-otsB-GFP表达载体.利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化本生烟草,将otsB导入到受体细胞中.通过组织培养和抗生素筛选,初步获得具有抗性的转基因本生烟草.     

蜂胶黄酮对PK-15细胞感染PPV与TGEV产生抗感染因子的比较

为了研究蜂胶黄酮对宿主细胞感染不同结构病毒后产生抗感染因子的影响,将蜂胶黄酮从最大安全质量浓度250mg/L倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis of pigs virus,TGEV)、细小病毒(porcine parvovirus,PPV)分别一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,ELISA法测定蜂胶黄酮对TGEV或PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子的含量。结果显示,与病毒对照组比较,在感染TGEV后2,12h的前期,蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS含量的能力;在感染PPV后2,12h的前期,只有较高质量浓度的蜂胶黄酮可以提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS含量的能力。PK-15细胞在感染病毒后24,48和72h,蜂胶黄酮对提高TGEV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力高于PPV。蜂胶黄酮提高有囊膜的TGEV感染宿主PK-15细胞产生抗感染因子能力高于无囊膜的PPV。     

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。     

猪链球菌Ide通用截短蛋白原核表达及纯化研究

为利用大肠埃希菌表达猪链球菌Ide通用截短蛋白,通过对Gen Bank公布的Ide S蛋白家族基因同源性分析,使用Primer 5.0软件设计一对特异性引物,以猪链球菌2型强毒株JZLQ全基因组为模板,采用PCR方法扩增Ide基因截短片段,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段分别克隆到p ET28a、p ET32a和p ET-sumo表达载体上,分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)。通过优化诱导温度及诱导剂IPTG浓度进行表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,PCR扩增片段大小约为1200 bp,经双酶切和测序验证构建正确;三种重组表达载体转化大肠埃希菌后均有目的蛋白表达,但不同表达条件下目的蛋白表达量存在差异,其中p ET28a-Tr Ide重组表达载体用25℃诱导、IPTG终浓度为1 mmol/L时可实现重组蛋白的高效可溶性表达,为IdeSsuis蛋白在猪链球菌通用疫苗研发方面的研究奠定了基础。     

蜂胶黄酮对病毒诱导PK-15细胞凋亡的影响

为研究蜂胶黄酮对病毒诱导宿主细胞凋亡的影响,将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)分别一起加至单层PK-15细胞培养体系中,用流式细胞仪检测蜂胶黄酮对TGEV和PPV感染PK-15细胞凋亡率的影响。结果显示,与病毒对照组比较,TGEV和PPV感染PK-15细胞后,蜂胶黄酮可以显著降低PPV感染引起的PK-15细胞凋亡率,而对TGEV感染引起的PK-15细胞凋亡率则没有显著影响。说明蜂胶黄酮可以减轻无囊膜的PPV感染对PK-15细胞引起的凋亡。     

蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响

本试验旨在研究蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响。首先采用MTT法测定蜂胶黄酮对宿主鸡胚成纤维细胞（CEF）和PK-15细胞的安全浓度;然后将蜂胶黄酮从最大安全浓度250 μg/mL开始倍比稀释至15.6 μg/mL共5个浓度,将蜂胶黄酮分别与新城疫病毒（NDV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪细小病毒（PPV）一起加到相应长成单层的宿主细胞CEF或PK-15中,在感染后24、48和72 h分别用MTT法测定宿主细胞的存活率,代表蜂胶黄酮提高宿主细胞抗病毒能力的指标。结果显示,蜂胶黄酮可显著提高宿主细胞抗病毒能力,这种活性与其剂量正相关,即剂量越大作用越好。蜂胶黄酮提高宿主细胞抗有囊膜病毒NDV和TGEV作用主要体现在病毒感染的前期,而提高宿主细胞抗无囊膜病毒IBDV和PPV作用主要体现在病毒感染的后期。提示蜂胶黄酮可用于NDV和TGEV的预防及IBDV和PPV的治疗。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

纳米蜂胶黄酮对猪细小病毒的体内外抗病毒作用

采用体内外试验研究纳米蜂胶黄酮抗猪细小病毒(PPV)作用。体外试验是以普通蜂胶黄酮为对照,分3种加药方式(先加蜂胶、后加蜂胶、蜂胶和病毒同时加入)加至PK-15细胞中,用MTT法检测细胞活性,实时荧光PCR检测PK-15中PPV含量,观察蜂胶黄酮对PK-15抗PPV及清除PPV能力的影响。体内试验是给豚鼠注射PPV后灌胃纳米蜂胶黄酮和普通蜂胶黄酮,检测肺脏、肾脏、肝脏、性腺及血液中PPV含量、血清中HI含量。结果显示:(1)与普通蜂胶黄酮相比,纳米蜂胶黄酮可显著抑制PPV在PK-15上生长,高浓度效果优于低浓度,3种加药方式中先加药物的效果最好;(2)高中剂量的纳米蜂胶黄酮可以显著抑制PPV在血液中复制、减轻PPV对豚鼠体重的影响、提高血清HI效价。结果表明:蜂胶黄酮经纳米化处理后,可以显著提高其抗PPV活性。     

鸡传染性贫血病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus, CIAV),本研究参照GenBank中CIAV的VP2基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测CIAV的CRISPR/Cas13a方法，并验证了该方法的特异性、敏感性和复合性。结果显示，该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性，特异性良好无交叉反应；灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合率。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h内可对CIAV进行快速的鉴别诊断，为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。