人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

SNAT2介导蛋氨酸对牛乳腺上皮细胞增殖与自噬的调节作用

钠离子依赖性中性氨基酸转运体2（SNAT2）是一种氨基酸转运蛋白，可转运中性氨基酸，广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物，也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子，但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响，并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点（LC3-Ⅱ）变化。结果显示，SNAT2过表达时，p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加，反之，p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时，LC3-Ⅱ表达量增加，免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖（trehalose，Tre）和蛋氨酸（methionine，Met）后，与单一添加Tre组相比，Met+Tre组p-mTOR表达量增加，LC3-Ⅱ表达量降低，胞浆内绿色自噬斑点减少；添加Tre和Met并抑制SNAT2时，p-mTOR表达量下降，LC3-Ⅱ表达量增多，胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明，SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。     

饲粮组成对牛乳中乳蛋白及乳脂肪合成与调控机理影响的研究进展

牛乳中的营养物质对人类健康有着相当大的益处,乳蛋白和乳脂肪作为牛乳营养品质的物质基础,还与奶牛生产性能息息相关,受到人们的广泛关注。本文从牛乳中基本营养物质的种类和功能出发,重点介绍了饲粮组成的改变及添加植物提取物、微量元素、微生态制剂等对乳蛋白及乳脂肪合成与调控机理的影响,为科学合理地调整饲粮营养组成,提高牛乳中乳蛋白率和乳脂率提供理论依据。     

牛乳体细胞数影响因素、控制及牛群管理

1体细胞数概念、影响及检测方法 生鲜乳中体细胞数（SCC），是指每毫升奶中的细胞总数，多数是白细胞（即巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞），其中约占牛体细胞数的98％～99％，其他1％～2％的体细胞是乳腺组织脱落的上皮细胞，其数量反映了牛乳产量、质量及牛体的健康状况。当乳腺被感染或受机械损伤后，体细胞会上升。     

驴乳和牛乳蛋白热稳定性的研究

通过对驴乳和牛乳采取4种不同的热处理研究,比较了不同的加热方法对驴乳和牛乳中蛋白质稳定性的影响。结果发现,驴乳的乳清蛋白在60℃已经完全变性,驴乳酪蛋白的变性温度介于90~100℃,变性温度比较窄,而牛乳的酪蛋白的变性温度比较高。研究表明,驴乳乳清蛋白的变性温度低于60℃,驴乳中的α-乳白蛋白相对较多,而β-乳球蛋白较少,牛乳则相反。相比较而言,驴乳的酪蛋白和乳清蛋白的变性率较高,而牛乳的热稳定性更好。说明控制温度和时间可获得不同变性程度乳制品。     

新疆巴州地区生鲜牛乳中β﹣内酰胺酶残留状况调查

为了解巴州地区的生鲜牛乳中β﹣内酰胺酶（解抗剂）残留状况,保证生鲜牛奶卫生质量安全,2014年4月至10月,在巴州辖区内16个生鲜乳收购站、5个规模化奶牛养殖小区、8个机械化挤奶厅、12个生鲜乳运输车辆和库尔勒市城郊周边的29个散生鲜乳销售点的范围内抽取了54份生鲜乳混合样品,采用SNAP快速检测试剂盒进行检测。结果检测出β﹣内酰胺酶阳性的样品2份,样品阳性率为3.7%。这说明仍需要加强对奶牛饲料和投入品的监督管理。此外,经实际测试,SNAP检测试剂盒具有携带方便、检测快速的特点,适用于奶站、乳制品企业、畜产品安检等部门对大批量奶样的检测。     

沙棘酸乳的研制

以沙棘汁和牛乳为原料，进行乳酸菌发酵，研制出沙棘酸乳。采用正交实验择出最佳配方。该产品具有较高的营养价值。     

盐酸头孢噻呋乳房注入剂(干乳期)

正1研发背景奶牛乳房炎是奶牛生产中最常见、最难防治、花费最多,严重影响奶牛业发展的疾病之一。据世界奶牛协会统计,全世界约有2.2亿头奶牛,1/3左右的奶牛患有各种类型的乳房炎。在欧洲的一些国家,临床乳房炎在每个泌乳期的发病率在20%~50%。在我国临床型乳房炎的平均发病率为33.41%,隐性乳房炎的阳性率在46.4%~85.7%,发病率均高于国外报道,特别是在环境卫生不良、挤奶时消毒不严、管理不到     

研究通辽地区荷斯坦牛乳中氨基酸含量的季节变化特点

本研究选择通辽地区1～5胎健康荷斯坦牛,泌乳阶段分别为泌乳初期（7～30d）、泌乳盛期（31～90d）、泌乳中期（91～210d）和泌乳后期（211d～停奶）各10头,并分4次采集乳样,即枯草期、返青期、盛草期和枯草前期,每个季节的重复数为40份;并系统地研究了通辽地区荷斯坦牛乳中氨基酸含量的季节变化。研究结果显示,通辽地区荷斯坦牛盛草期、枯草前期乳中氨基酸总量（TAA）的差异不显著（P〉0.05）,但显著高于返青期（P〈0.05）,而显著低于枯草期（P〈0.05）;枯草期乳中必需氨基酸总量（EAA）和非必需氨基酸总量（NEAA）显著高于其他三季（P〈0.05）,而其他三季间差异均不显著（P〉0.05）。