家蚕质型多角体病毒(苏州株)S10片段的cDNA克隆及序列分析

为了探讨质型多角体病毒基因的遗传与变异,通过RT-PCR从家蚕(Bombyx mori)质型多角体病毒(Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,CPV)苏州株(BmCPV-suzhou)的dsRNA中成功克隆了S10片段。该片段cDNA含有一个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码由248个氨基酸残基组成的多角体蛋白,其分子量为28.46kD,等电点为7.12。比较不同宿主来源的CPV多角体蛋白基因氨基酸序列发现,同型CPV多角体蛋白基因高度相似,而不同型的CPV多角体蛋白之间几乎没有同源性;基于质型多角体蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与舞毒蛾(Lymantria dispar)CPV(LdCPV)和马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)CPV(DpCPV)聚为一类,表明三种CPV的亲缘关系较近。研究结果为深入探讨质型多角体病毒的变异与分子进化提供了新的参考。     

中华绒螯蟹1种球状病毒颗粒的电镜观察

中华绒螯蟹(Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｓｉｎｅｎｓｉｓ)养殖病害问题已成为制约养殖生产的主要因素,病害造成的损失逐年增长,损失也越来越严重。1996年以来,江苏、浙江、安徽等地相继发生养殖中华绒螯蟹患颤抖病成批死亡的病例,养殖单位采用多种抗菌药物治疗均无明显效果。病蟹...     

piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用

为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性,实验通过将PAβ启动子控制的DsRed表达元件插入pigA3GFP中,构建转基因载体pigA3GFP-AβDsRed。用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染,结果显示,通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中,来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性。将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP-AβDsRed分别与辅助质粒helper-pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后,经荧光观察、PCR鉴定、Dot blotting鉴定,证实获得了转基因金鱼和转基因泥鳅。研究表明,PB转座子在鲤科鱼类及鳅科的一些鱼中具有转座活性。     

家蚕热休克蛋白基因Bmhsp19.9启动子的活性分析

通过PCR扩增出家蚕(Bombyx mori)热休克蛋白基因Bmhsp19.9启动子的序列,TA克隆后进行序列测定,并构建重组载体进行瞬时表达.结果显示,该基因序列长为1 258 bp,具有典型的热激蛋白启动子的结构特点;序列分析显示,hsp19.9启动子区域可形成潜在的复杂茎环结构,推测其与启动子的功能有关.瞬时表达试验结果显示,hsp19.9的启动子能通过热诱导在家蚕BmN细胞和家蚕组织中驱动红色荧光蛋白报告基因(DsRed)瞬时表达,表明所克隆的hsp19.9启动子序列具有热休克蛋白基因的启动子活性.     

苏州市患病水生动物体内细菌的分离鉴定及药敏试验

为了解苏州市不同地区患病水生动物组织中感染细菌的种类及其耐药性,于2014年6～10月从不同地区采集的患病鱼、虾、蟹和中华鳖组织中共分离到14株细菌,通过16S rRNA基因分析对细菌进行了鉴定,并调查了他们对链霉素、恩诺沙星、强力霉素、庆大霉素硫酸盐和甲砜霉素等5种抗生素的抗性及最低抑菌浓度。结果显示:从不同地区水生动物分离到的同种细菌对同种抗生素的抗性有明显差异,其中,分离到的嗜水气单胞菌及摩根氏菌有多重耐药性;对14株细菌进行质粒抽提和琼脂糖凝胶电泳分析,发现8株细菌中存在分子量不同的质粒,且不同地区来源的同种细菌所含有的质粒的分子量不同,耐药性较强的嗜水气单胞菌和摩根氏菌均含有质粒;嗜水气单胞菌质粒的序列测定结果显示,该质粒与其抗药性无关;转化实验结果显示,从摩根氏菌分离的1.8 kb质粒与氨苄青霉素抗药性有关。     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

家蚕JAK/STAT信号通路相关基因克隆与分析

【目的】鉴定家蚕JAK/STAT信号通路组成原件,并预测家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因的功能。【方法】在电子克隆的基础上,通过RT-PCR获得家蚕JAK/STAT信号通路的主要相关基因;利用在线软件对相关蛋白进行结构域分析;基于microarray数据库或qPCR分析各基因的组织表达特征。【结果】克隆了家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因,包括BmSTAT、BmHOP、BmSOCS2、BmSOCS5A、BmSOCS5B、BmSOCS6、BmDRK、Bmken、BmPIAS1、BmPIAS2以及BmPI3K,但没有能克隆到果蝇Upd1、Upd2和Upd3的同源体基因。序列分析显示BmHOP具CRD_FZ、Kringle、转膜区域和PKc超家族蛋白激酶催化结构域TyrKc;BmSTAT有2种亚型,均具SH2、STAT_bind、STAT_int和STAT_alpha结构域;在克隆的BmSOCS家族的3个基因中,BmSOCS2A和BmSOCS6A具典型的SH2和SOCS结构域;BmDRK由SH3和SH2两种结构域形成了SH3-SH2-SH3串联结构;BmKen存在BTB和锌指结构域,BmPIAS1和BmPIAS2具有LCR结构域,BmPI3K具有2个SH2结构域。【结论】成功克隆了家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因。相关蛋白的保守结构域分析显示,在家蚕JAK/STAT信号通路中,BmHOP是JAK激酶的一种,可以磷酸化BmSTAT转录因子,激活靶基因转录;BmSOCS、Bmken、BmPIAS1以及BmPIAS2对JAK/STAT通路起负反馈作用。     

中国野桑蚕mtDNA中A+T丰富区片段的克隆及序列分析

对中国野桑蚕mtDNAA +T丰富区片段进行了克隆和序列分析。在所测定的 72 0bp左右的片段中 ,A +T含量为 92 0 8% ,与不同家蚕品种的mtDNA相近 ,中国野桑蚕与家蚕之间的核苷酸序列呈高度同源性 (98%以上 ) ;但与日本野桑蚕相比 ,中国野桑蚕mtDNA的A +T丰富区片段 ,缺少 2个 12 6bp的重复单位 ,A +T含量低 0 9% ,核苷酸序列同源性也较低 (72 % )。该片段与中系家蚕mtDNA比较 ,有 15个变异位点。对mtDNAA +T丰富区的中国野桑蚕和日本野桑蚕及中系、日系和韩国的 4个家蚕品种进行聚类分析表明 ,日本野桑蚕有可能由中国野桑蚕分化而来。     

网络版蚕病诊断与防治专家系统设计

为普及家蚕病害的基础知识,辅助提高蚕病诊断的准确率和蚕病防治技术水平,采用微软成熟的IIS+ASP+ACCESS技术建立了基于Internet的包含19种主要家蚕病害在内的诊断与防治专家系统(http:∥211.90.162.131:8099/)。该系统包括蚕病基本知识、识别与诊断知识、发病规律与防治知识、辅助诊断系统以及咨询与影像系统。计算机模糊判断法是辅助诊断系统的核心模块,该模块通过将专家经验转化为可供计算的模式概率值,建立数据库,即可从已知的病征(事实、证据)出发,采用模糊产生式诊断规则给出模糊断言的最大值作为诊断结果,并自动提出相应的防治措施。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。