真核表达质粒pTracer-CMV2FIL2在鸡体组织中表达及分布规律

将3周龄的三黄鸡肌肉接种200 μg真核表达质粒pTraeer-CMV2FIL2,巢式PCR法检测血清、心、脾脏、肺脏、法氏囊、脑、骨髓、胸腺和肌肉接种部位中pTracer-CMV2FIL2出现和存留的时间;荧光定量PCR法检测其在血液中的动态变化;RT-巢式PCR法检测其在上述部位的表达情况.结果显示,接种后2～3 h血清中可检测到pTracer-CMV2FIL2,6 h时在血液中的含量最高,7 d时已经检测不到;4 h后在上述器官中可陆续检测到pTracer-CMV2FIL2的出现,13 d后陆续消失;1 d后可陆续检测到质粒所转录的mRNA,13 d后陆续消失;接种后2 h可在接种部位肌肉的细胞中检测到pTracer-cMV2FIL2的出现,10 h可检测到mRNA,150 d时仍然可以在肌肉接种部位的细胞中检测到质粒和mRNA存在.     

多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点，设计合成了二对引物XZ1，XZ2和XZ45、XZ46，建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明，用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR，强毒株只扩增出732bp一条带，而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带，而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带，结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体(MG)、滑液囊霉形体(MS)、衣阿华霉形体(MI)和火鸡霉形体(MM)的基因文库，设计了4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物，用这4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果，均同时得到了4条特异性的大小与试验设计相符的732bp(MG)、207bp(MS)、299bp(MI)、850bp(MM)多重PCR扩增带，而对其他6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，此多重PCR能同时检出1pg的MG、MS、MI和MM DNA模板。     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.     

猪圆环病毒2型广西株的分离和全基因组序列分析

从广西表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪群中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV-2),命名为GXB株.对GXB株的全基因组进行PCR扩增,扩增产物克隆至PMD18-T载体.测序结果表明,全基因组为1 767 bp,与GenBank上已知的8株PCV-2参考株序列的同源性在95.0%～99.6%之间.序列分析表明,GXB株基因组包含11个读码框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的读码框,分别编码314个和233个氨基酸,与其他PCV-2毒株的ORF1、ORF2氨基酸的同源性分别为97.8%～100%、91.5%～98.7%.对GXB株ORF2编码的Cap蛋白基因进行功能分析,表明含有1个潜在的糖基化位点,3个明显的亲水区,有较强的抗原性和亲水性,为作为主要的免疫原性蛋白基因提供了依据.     

重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑.[方法]以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件.[结果]重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1h,再以5％脱脂奶封闭1h,血清（一抗）经1∶200倍稀释后作用1h,然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）作用1h.该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1：320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0％.[结论]建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测.     

鸡毒支原体(MG)地高辛探针的制备

从带有鸡毒支原体(MG)732bp 16SrRNA DNA片段的重组质粒中回收．并制备出地高辛标记的MG DNA探针。其特异性检测结果表明．该探针能与MG不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应，而与对照NDV、ILTV、MS、MI和MM等病原抽提的核酸的杂交反应均为阴性。敏感性结果表明．该探针对MGDNA的最低检出量为1ng。应用该探针对人工感染MG的SPF鸡的咽喉棉试子进行检测，结果均出现杂交显色反应。表明所制备的探针用于MG的检测是可行的。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。