兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组兔出血症病毒核衣壳蛋白(VP60)为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备抗衣壳蛋白的单克隆抗体,获得了2株能稳定分泌抗VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AE11和AH4).分别利用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)等方法对单抗的免疫活性和特异性进行检测,结果证明,此两株单抗均能识别重组的VP60和天然病毒的衣壳蛋白,而IFA结果显示只有AE11能和RHDV反应,可观察到强烈的特异性绿色荧光,表明成功制备了抗RHDV的VP60特异性单抗.     

猪繁殖与呼吸综合征的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征 (Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ,ＰＲＲＳ)是一种新发现的传染病。主要引起怀孕母猪的早产、流产、死胎及仔猪的呼吸系统症状。 1987年美国首先报道了该病的发生[1] ,随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病[2～ 5] 。 1991年初 ,我国台湾地区出现此病[6] 。 1996年 ,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似ＰＲＲＳ病例中分离到ＰＲＲＳ病毒[7] ,从而证实了本病在我国的存在。最初 ,人们由于不能确定其病因 ,故称其为 ,“猪神秘病”(Ｍｙｓｔ…     

猪圆环病毒致病性的分子基础

猪圆环病毒（porcine circoviruses，PCV）因为被发现与断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪肾病综合征（PNDS）以及仔猪先天性震颤等多种疾病的发生有关联，才逐渐引起人们的关注。越来越多的证据表明，PCV在猪群中的高感染率已是严重威胁世界养猪业健康发展的重要因素之一。然而，迄今我们对该病毒致病性的分子机制以及免疫机理等仍不是很清楚，可喜的是国内、外学者已对之进行了多方面的研究，并取得了丰硕研究成果。下面作者对近年来有关PCV分子生物学及免疫学方面的研究成果进行了综述，以期能对我国有关PCV的研究提供帮助。     

聚合酶链反应技术及其应用

聚合酶链反应（PCR）技术自1985年发明至今不断得到发展和完善，在常规PCR技术的基础上，结合免疫学、计算机技术、原位杂交等技术的利用和相关仪器的运用，衍生出了各种PCR方法和技术，如原位PCR、复合PCR、反向PCR、定量PCR、不对称PCR、电子PCR及PCR芯片等。这些衍生出的PCR新类型和新方法有着独特的技术特点，解决了以往传统PCR的局限性。PCR技术作为一种革命性的新技术将不断推动分子生物学及相关学科的发展，并广泛应用于病原诊断、基因表达、遗传病检测等生命科学研究领域。     

密码子优化型鸭甲肝病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

为了提高基因A型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）VP1基因在昆虫细胞中的表达水平,本研究根据昆虫细胞密码子偏爱性对野生型DHAV VP1（wtVP1）基因进行改造,合成了optiVP1基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建了重组杆状病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1,分别转染对数生长期的sf9昆虫细胞表达VP1蛋白。转染72 h后,sf9细胞出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）, Western-blot和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果表明VP1蛋白在重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得了良好表达。用Image J软件对Western-blot扫描的图片进行灰度分析发现, optiVP1基因在昆虫细胞中的表达水平明显高于wtVP1。本研究为进一步研制诊断抗原和新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9~19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征。建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要。为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因原核表达质粒pET-30a-Cap,转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot检测Cap蛋白的表达。大量表达并纯化重组蛋白后,将其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠抗体效价,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果显示:获得的重组蛋白分子量约为28 kDa;通过3次亚克隆筛选最终获得5株杂交瘤细胞株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11,抗体效价均可达1:51~200以上;1A5G10、5B7G8、9C3E11重链为IgG1型,1C11B11、9A12B12重链为IgG2b型,轻链均为κ型;制备的单克隆抗体均可与重组蛋白反应或GoAstV发生反应;其中5B7G8株与GoAstV发生反应,1C11B11、9A12B12株与GoAstV发生反应。本研究结果为GoAstV诊断方法的建立以及GoAstV Cap蛋白功能的进一步研究奠定了坚实基础。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究

根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。     

侧流免疫层析技术在兽医诊断中的应用

侧流免疫层析使用有色标记物、荧光标记物或其他标记物等作为标记物，用于偶联抗原(抗体),用以检测抗体(抗原)的一种免疫化学反应。传统的侧流免疫层析依赖于肉眼观察，灵敏度较低，只能提供定性或半定量结果。新一代侧流免疫层析技术采用不同类型标记物和应用外部设备，对待检物进行量化，来呈现待检物的含量，从而实现开发具有定量、多组分检测能力的免疫层析测试。论文总结了侧流免疫层析标记物、检测原理以及在兽医诊断中的应用，以期为今后侧流免疫层析技术在兽医临床诊断中的应用和改进提供理论参考。