猪 Siglec-10基因的克隆与生物信息学分析

为了研究猪 Siglec-10（pSiglec-10）的分子生物学特征,利用 Ensemble 网站提供的预测序列（ENSSSCT00000032460）设计一对特异性引物,采用 RT-PCR 技术,克隆 pSiglec-10分子的全长 CDS 区,经过测序比较鉴定正确后,对该分子的基本特征进行分析;构建截短 pSiglec-10的原核表达载体,另将该分子的 CDS 区全长克隆至真核表达载体 pcDNA3．1-3′FLAG,将重组质粒转染至 PK-15和 Marc-145细胞中分析其表达定位特征。结果克隆的 pSiglec-10分子的全长 CDS 为2127 bp,编码709个氨基酸;pSiglec-10基因序列与猴的同源性最高,同源性达73．6％,与鼠的同源性为66．9％;与人的同源性为62．5％,氨基酸序列的同源性分别为58．9％、69．4％和65．3％;pSiglec-10 C 端的 ITIM 区域和磷酸化位点高度保守;pSiglec-10分子具有较好的抗原特性和亲水性;该分子主要表达定位在细胞浆中,在 Marc-145细胞中呈不连续的点状分布于细胞浆,细胞核周围荧光强度较强。pSiglec-10分子全长 CDS 区的克隆和分析将对该分子的功能研究提供一定的理论依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

番鸭源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

为了解番鸭源鸭疫里默氏杆菌的耐药性,本研究对疑似鸭疫里默氏杆菌感染的发病番鸭进行细菌分离培养、革兰氏染色镜检、病鸭病原检测、生化试验、16S rRNA序列分析、PCR鉴定、药敏试验和耐药基因检测。细菌分离结果显示,分离菌在鲜血琼脂培养基上长出表面光滑、边缘整齐、有光泽、半透明的奶油状针尖大小菌落;革兰氏染色镜检呈革兰氏阴性短小杆菌,命名为GZQN201907。GZQN201907生化试验中尿素反应阳性,葡萄糖、麦芽糖、乳糖等生化反应呈阴性。其16S rRNA系统进化树与鸭疫里默氏杆菌处于同一分支;并且分离菌鸭疫里默氏杆菌OmpA基因PCR鉴定结果为阳性。其对头孢呋辛、红霉素、头孢他啶等18种抗菌药耐药,对羧苄西林和环丙沙星中度敏感,对新霉素和复方新诺明敏感。而耐药基因能检测出β-内酰胺类耐药基因VIM、TEM,四环素类耐药基因tetB,大环内酯类耐药基因ermB和ermF。药敏试验与耐药基因检测结果说明,GZQN201907对β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类3类药物的耐药表型和耐药基因检测结果一致。动物回归试验中接种GZQN201907的雏鸭在72 h内全部死亡,而对照组雏鸭未出现任何症状,说明GZQN201907对雏鸭有致病力。试验成功分离到1株番鸭源鸭疫里默氏杆菌,为鸭疫里默氏杆菌病的防治奠定基础。     

不同新城疫病毒株结构蛋白的分析

2株新城疫病毒ND98、ND99分别分离自发病鸡群与雏鸵鸟，ND98属于中发型毒株，ND99属于缓发型毒株。将2株分离株ND98、ND99与参考毒株F48E8、Lasota进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质转移印迹(Western-Blotting)。SDS-PAGE结果显示，ND98、ND99与F48E8、Lasota具有相似的结构蛋白：HN蛋白、F蛋白、NP蛋白与P蛋白、M蛋白；Western-Blotting试验显示，ND98与F48E8、ND99与Lasota具有相似的免疫原，ND98、ND99免疫原性存在一定的差异。     

蛋鸡J亚群禽白血病与马立克氏病混合感染的诊断

禽白血病与马立克氏病均为肿瘤性疾病.禽白血病属反转录病毒科,禽C型反转录病毒属,划分为A～J 10个亚群[1].1991年Payne首次报道,从商品代肉用鸡中分离得到J亚群禽白血病病毒(ALV-J),主要引起肉鸡的髓细胞瘤[2].……     

RT—PCR对新城疫病毒（NDV）分离株的鉴定及其临床应用

采用新城疫病毒的通用引物PA PB、强毒引物PA PC、弱毒引物PA PD对11株贵州新城疫分离毒株与4株新城疫参考毒株进行了RT-PCR扩增.结果15株新城疫毒株均被PA PB引物扩增出359 bp的条带,F48E8、ND98、Fw、H2、P3、BY、L2、P1,P2被PA PC引物扩增出254 bp的条带,而PA PD引物未扩增出DNA条带;ND89、Lasota被PA PD引物扩增出254 bp的条带.而PA PC引物未扩增出DNA条带.采用3对引物对自然发病斗鸡脑、脾、咽喉试子、泄殖腔试子进行RT-PCR检测,确诊为斗鸡新城疫强毒感染,且与传统病毒分离与毒力鉴定的结果相一致.     

定点屠宰场（点）猪肉中三种主要食源性致病菌污染情况调查

为了解本地生猪定点屠宰场(点)猪肉中的沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌3种食源性致病菌污染情况,对10个场(点)出场的猪肉进行抽样,采用沙门氏菌测试片、大肠杆菌O157:H7测试片及李斯特菌检测板进行快速检测,再用国标法对快速检测出的阳性样品进行复检鉴定。结果显示:50份样本中,检出沙门氏菌阳性7份,阳性检出率为14%;20份样本中,检出大肠杆菌O157:H7阳性1份,阳性检出率为5%,检出单增李斯特菌阳性5份,阳性检出率为25%。此外,还发现样本中存在细菌的混合污染,其中沙门氏菌和单增李斯特菌双阳性2份,3种菌全阳性1份。调查结果表明:本地屠宰场出场猪肉中,这3种主要食源致病菌污染情况较严重,特别是小型屠宰点,应引起监管部门重视,加快推进屠宰企业转型升级;快速测试片的检测结果准确性偏低,特异性差,需要尽快建立一种快速特异的检测方法,用于屠宰场的致病菌快速检测。     

敲除小RNA gcvB后沙门菌的转录组分析

为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

一例山羊传染性胸膜肺炎的诊断与防治

2017年11月份,贵州省某乡镇分两批购进15～20 kg黑山羊333只,购进第二批第12天开始发病,先后死亡超过90只,为了摸清发病死亡原因,笔者进行了流行病学调查、病理解剖和实验室检查,确定本次发病主要为山羊传染性胸膜肺炎,采取综合防控措施后病情得到有效控制。