猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因,得到约920bp的片段,与参考序列的核苷酸同源性达99.3%,定向克隆到pET32a(+)中,转化BL21(DE3)经诱导后毒素Ⅰ基因得到高效表达Westernblot鉴定呈阳性     

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌.志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子.选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,...     

猪用超级料精的配方筛选研究

本试验选用体重为１５ｋｇ的三元杂交瘦肉型仔猪２００头，平均分为４组，对４个浓缩饲料配方进行筛选。经１２０天的对比试验，结果找到了一个较为理想的浓缩饲料配方（即Ｃ组配方）；若应用本试验的Ｃ组配方的日粮饲喂（体重１５ｋｇ￣１２０ｋｇ）商品瘦肉型猪，则可使每头猪平均日增重达８５８．３ｇ，料肉比达３．０６：１，可获利润为２２２．２０元／头。     

掌克古茶树无性系苗主要形态性状和生化成分的分析

为明确掌克古茶树无性系苗主要形态性状和生化成分的遗传多样性,为科学合理利用掌克古茶树种质资源提供依据。本研究以43份掌克古茶树两年生无性系苗为材料,田间调查其主要形态性状,测定春梢一芽三叶生化成分,并进行综合分析和评价。结果显示,掌克古茶树无性系苗主要形态性状的变异系数为16.55%～37.30%,遗传多样性指数为0.95～2.04;春梢生化成分变异系数为14.49%～28.75%,多样性指数为1.44～1.93。各形态指标和生化成分之间有一定的相关性。主成分分析将13个指标简化为5个因子,累积贡献率达到68.28%。在欧式距离10处,43份材料被分为三大类群;类群Ⅰ包含24份材料,类群Ⅱ包含10份材料,类群Ⅲ包含9份材料。掌克古茶树无性系苗主要形态性状和生化成分的变异较大,遗传多样性丰富;聚类到类群Ⅲ的ZK7、ZK11、ZK13、ZK15、ZK16、ZK22、ZK19、ZK23、ZK37等材料综合性能较好,具有较高选育价值。     

猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus, RVA)VP6基因节段，并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4 096 000,能够与不同基因型的RVA反应，同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应，为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。     

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和Hind Ⅲ双酶切的线性化pET-32a (+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D_{600 nm}值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37 ℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度＞95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10⁴U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。     

猪抗病毒蛋白基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要的技术。     

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响，以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出FILIP1L基因，克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因，通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况，并研究其抗病毒功能。结果：成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒，转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后，FILIP1L基因的mRNA表达显著上调；过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制；下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上，FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制，研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。     

1株猪流行性腹泻病毒CH/JSNT/2022/Jan株的分离及其S基因遗传进化分析

2022年1月份江苏南通一养猪场产房仔猪发生严重腹泻，发病率和死亡率均超过80%,原因未知。死亡仔猪肠道样本经RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PoRV),结果显示：仅PEDV检测为阳性，TGEV、PDCoV和PoRV检测均为阴性。将处理好的肠内容物接种Vero细胞，接种后48 h即观察到典型细胞融合、聚集成合胞体的PEDV典型细胞病变，且能够在Vero细胞上稳定传代，表明成功分离到病毒，并将其命名为CH/JSNT/2022/Jan株。通过电镜观察，观察到近似球形、直径约为100 nm、表面有囊膜和纤突的冠状病毒样粒子，表明分离毒株可能为PEDV。进一步对该毒株的S基因进行测序，序列相似性分析结果显示，分离毒株CH/JSNT/2022/Jan与PEDV S基因参考毒株的核苷酸序列相似性为93.5%～99.7%,氨基酸序列相似性为92.8%～99.9%;遗传进化分析结果显示，该分离株为GⅡa型，与多个2020年和2021年中国流行株处于同一进化分支，与疫苗株CV777、AJ1102和LW/L的遗传进化距...