小鼠催乳素释放肽的初步克隆

为克隆并分析小鼠催乳素释放肽基因,从小鼠下丘脑提取总RNA,进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T连接后转化E.coli DH5α,检测阳性克隆并测序。测序结果表明,所得序列与大鼠催乳素释放肽编码区序列的相似指数为86.3%。克隆所得序列为小鼠催乳素释放肽的基因片段。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

不同时期小鼠睾丸合成睾酮能力的差异

不同发育阶段,睾丸合成睾酮的能力差异很大。为了阐明引起睾酮合成差异的分子机制,实验以不同年龄的SPF昆白小鼠,采用RT-PCR与Western blot分析了不同年龄阶段类固醇合成酶的变化。结果显示:(1)在不同年龄阶段,P450scc(胆固醇支链裂解酶)mRNA、3β-HSD(3β-羟胆固醇脱氢酶)mRNA、StAR(类固醇合成快速调节蛋白)mRNA和蛋白的水平无明显变化;(2)P450c17(C17-20裂解酶)mRNA的表达水平在30、60和120d均处于较高的水平,但是在270d则处于较低的水平;(3)30~270d,细胞外信号调节激酶(ERK)活性无明显变化。表明,P450c17 mRNA表达差异可能导致不同时期睾酮合成能力差异的重要原因,但ERK活性可能与衰老引起睾酮合成能力下降无直接关系。     

中药有效成分对小鼠2-细胞胚胎体外发育的作用

如何获得更多具有活力的可操作的桑椹胚、囊胚一直是胚胎体外培养的研究热点。近二十年来,虽经采用改进培养液成分、改善培养条件、建立体细胞与胚胎共培养体系和添加生长因子、细胞因子等手段,胚胎质量有所提高,但体外受精卵的囊胚发育率仍远低于体内受精,与体内受精囊胚相比,体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数量明显减少,胚胎移植妊娠率和产仔率较低,这些问题均严重影响了胚胎工厂化生产和胚胎产业化的发展,以及育种工作的进程。因此,探索开辟胚胎体外培养生长发育的新途径,提高其发育率和移植妊娠率显得尤为必要。目前,国内外有关中草药有效成分对体外胚胎发育作用的研究甚少。本研究以ICR小鼠2-细胞胚胎为试验材料,将中药有效成分黄芩苷(Baicalin,Bai)、川芎嗪(Ligustrazine,Lig)和小檗碱(Berberine,BR)添加于mCZB基础液中,并以添加双抗的mCZB基础液为试验对照组,比较其对胚胎体外发育的影响。结果表明,体外培养120 h的胚胎孵化率,Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)及BR组(75.9%)极显著高于对照组(51.8%)(P<0.01)。孵化胚胎细胞计数,BR组、Lig组和Bai组(分别为87.2±8.6、83.9±7.7和81.9±6.2),与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P<0.01)。说明3种中药有效成分均能显著促进小鼠早期胚胎的体外发育及胚胎细胞增殖。为进一步探讨Bai、Lig、BR对胚胎体外培养发育的效果和验证其胚胎质量,将不同组别培养至桑椹、囊胚期的胚胎进行两种程序常规冷冻,解冻后继续培养,观察其冷冻效果,并将各组解冻后发育至囊胚期胚胎移植。结果表明:冷冻解冻桑椹胚体外培养8~14 h囊胚发育率,程序一中Bai组(65.8%)和Lig组(81.1%)分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)地高于对照组(48.6%)和BR组(46.7%);程序二中Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)极显著高于对照组(55.2%)和BR组(47.6%)(P<0.01)。冷冻解冻囊胚体外培养6~8 h囊胚发育率,程序一中各组间无显著差异(P>0.05);程序二中,中药有效成分各组间差异不显著(P>0.05),但均显著高于对照组(P<0.05)。两种冷冻程序效果差异不显著(P>0.05)。移植妊娠率和产仔率,Bai组(56.3%,63.3%)、Lig组(52.6%,67.3%)和BR组(55.0%,60.5%)均高于对照组(46.2%,52.8%)。说明3种中药有效成分对于提高小鼠2-细胞胚胎体外发育质量具有一定促进作用,并有利于提高冷冻解冻后移植胚胎的发育潜力。     

果蔬复合固体饮料的制备及其对小鼠肝性骨病的预防作用

为开发一种感官营养俱佳的保健食品，该研究以欧李、猕猴桃、胡萝卜、葡萄、柑橘5种果蔬为原料，用喷雾干燥法制备复合固体饮料（以下简称“五果粉”），后以五果粉饲喂雌性C57小鼠，测定血清指标，分析骨微结构，探究其对高脂饮食诱导的小鼠肝性骨病的预防作用，为五果粉的制作和营养保健功能提供依据。结果表明：5种果蔬的配方比例为40%欧李、20%猕猴桃、20%胡萝卜、10%柑橘、10%葡萄。添加可溶性固形物总量的40%的复合助干剂（麦芽糊精∶分离乳清蛋白=30∶10）与3%的稳定剂羧甲基纤维素钠，喷雾干燥条件：进风温度126℃、进料速度6.3m L/min、转子流量计高度44.00mm、可溶性固形物含量11.00%，在该条件下生产的五果粉集粉率60.86%。血清试验结果表明，给药组小鼠血清中骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶5b的水平显著低于模型组（P<0.05）；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著高于模型组（P<0.05），丙二醛水平显著低于模型组（P<0.05）；谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著低于模型组（P<0.05），且与空白组相比无显著差异（P>0.05）；总胆固...     

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。     

穿心莲内酯对小鼠呼吸道非特异性免疫的影响

穿心莲为爵床科穿心莲属植物,具有清热解毒、凉血消肿等作用,人医临床常用于呼吸道感染和肠道感染的治疗.在兽医领域,穿心莲制剂常作为替代抗生素的中药材,广泛用于动物保健、疾病防治及免疫调节等方面[1-3].目前,对穿心莲内酯的研究主要集中在抗炎、抗菌、抗病毒机理及临床疗效等方面[4-6],而对呼吸道非特异性免疫方面的研究少见报道.本试验应用穿心莲内酯对细菌性肺炎模型小鼠进行治疗,观察其对小鼠呼吸道非特异性免疫的影响,探索穿心莲对治疗呼吸系统疾病的作用机理.     

淫羊藿多糖提取工艺的优化及对小鼠细胞免疫功能的影响

淫羊藿为小檗科淫羊属植物,是传统的补肾助阳中药.现代药理试验结果表明,淫羊藿能增加心脑血管流量,促进造血功能、免疫功能及骨代谢,具有抗衰老、抗肿瘤的功效.多糖是淫羊藿发挥免疫调节作用的有效成分之一,试验在传统水提醇沉法的基础上运用超声波法提取淫羊藿多糖,通过正交设计优化并建立淫羊藿多糖的最佳提取工艺,并进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞转化试验,以探讨淫羊藿多糖对小鼠细胞免疫功能的影响.     

热应激对小鼠附睾内精子的形态学影响

用不同温度（42℃、37℃和33℃）,每天在固定时间对小鼠实施1h的热应激处理。在热应激持续到8d、13d、21d、35d时,颈椎脱臼处死小鼠,取附睾尾制备精子悬液并测定其密度,用改良巴氏染色法检测精子顶体完整率和畸形率。结果：42℃组热应激处理的小鼠附睾内精子密度和顶体完整率,随着热应激持续时间的延长而不断降低,畸形率则不断升高,且与对照组间有显著（P〈0．05）差异;37℃和33℃组热应激处理的小鼠附睾内精子密度、顶体完整率和畸形率,随着热应激持续时间的延长都不断的增加,但都显著（P〈0．05）低于或接近（P〉0．05）对照组的水平。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.