一株乳酸杆菌的分离鉴定及其体外抑菌和抑制伪狂犬病毒增殖的研究

旨在研究乳酸杆菌能够抑制一些病原菌生长和抗病毒方面的作用,为制备乳酸杆菌类微生态制剂提供参考。本试验从泡菜中分离出乳酸杆菌,通过革兰染色镜检、生化试验以及对菌株16S rRNA基因序列进行分析,鉴定分离细菌为植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum),对分离到的菌株采用琼脂扩散法,以大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌为指示菌检验其抑菌效果;利用荧光定量方法检验其对伪狂犬病毒的抑制作用。结果表明分离的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌有较高的抑制作用,抑菌圈直径平均分别为18. 3 mm、18. 0 mm、19. 0 mm;荧光定量方法检验其具有一定的抗伪狂犬病毒活性作用,抑制病毒复制作用明显。综上表明,分离的乳酸杆菌抑制大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌以及伪狂犬病毒效果明显,丰富了乳酸杆菌资源,同时为其在微生态制剂中的应用及功能性产品的生产提供依据。     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

免疫复合物对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的PAM细胞因子转录的影响

本试验通过研究免疫复合物影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在巨噬细胞内增殖的因素,来进一步探讨免疫复合物经FcγR介导的PRRSV感染机制.本研究将含200 TCID50 PRRSV病毒液与等体积的终浓度为1.30 mg· mL-1的猪IgG-兔抗猪IgG复合物分别先后和同时接种于PAM细胞,分别于12、24、36、48 h收集细胞液,同时设PRRSV感染对照组、免疫复合物对照组和健康细胞对照组,利用建立的相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR方法分别检测巨噬细胞中IFN-α、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平及PRRSV的RNA水平,并进行定量分析,同时采用ELISA方法检测健康细胞中IFN-α的蛋白水平.结果显示,在感染后12～36 h期间,免疫复合物能够抑制PRRSV诱导的IFN-α的mRNA水平,TNF-α mRNA水平在感染后12 h被促进,而在24～36 h期间被抑制.在感染后48 h,免疫复合物能促进IFN-α和TNF-α的mRNA水平,而在12～48 h期间均能抑制IL-10的mRNA水平,此外,免疫复合物在感染12、24和36 h时间段内均能明显促进病毒的增殖,但在48 h后不显著.健康细胞中IFN-α的蛋白水平在培养12～48 h之内呈“降-升-降”的趋势.结果表明,IFN-α蛋白的表达与其mRNA的转录不同步.在PRRSV感染初期,免疫复合物能抑制PRRSV诱导的抗病毒因子的mRNA水平,病毒的复制被促进,而在感染后期,抗病毒因子达到一定的浓度后发挥抗病毒作用,在一定程度上抑制病毒的复制.而TNF-α的转录规律不明显,表明免疫复合物可能同时与激活型和抑制型FcγR结合来共同调节PRRSV诱导的细胞因子的转录.     

河南省狂犬病流行病学调查与防制研究

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病,也是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,一旦发病,病死率高达100%,全世界每年约有3.5万～5万人死于狂犬病,主要分布在亚洲、非洲等发展中国家犤1,2犦。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感,发展中国家狂犬病主要传染源是病犬,其次是猫和狼,发达国家由于犬的狂犬病已被控制,主要由野生动物传播犤3犦,食虫蝙蝠和食血蝙蝠也往往是陆栖哺乳动物的重要传染源犤4犦。我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一,2000多年前就有狂犬病记载犤5犦。河南省狂犬病流行时间长,发病率处于国内较高水平,20世纪90…     

仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定

从济源、通许等7地采集的7份仔猪黄白痢和仔猪水肿病的病料,经麦康凯、伊红美蓝分离培养后,挑取红色或紫黑色带金属光泽的菌落,再经肉汤纯培养,然后采用生化试验、动物试验和血清学试验进行鉴定,结果显示均为致病性大肠杆菌。药敏试验结果表明,分离菌对来立信、杀菌王都敏感,而对复方新诺明产生耐药性。     

鸡新城疫病毒V_(-4)株的生物学特性研究

本试验证实V_(-4)株对1日龄雏鸡安全,10日龄1次饮水或滴鼻免疫,半年之内,HI抗体效价平均滴度为2~5左右,100EID~(50)F系标准强毒(毒力为10~(8·5)EID_(50)/0.1ml)攻击,保护率100％。并且成功地培育了能在56℃水浴处理5小时而血凝效价稳定的耐高温毒株V_(4-92),可在4℃和25℃保存4周,血凝效价不降。     

PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于104拷贝·μL-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于105拷贝·μL-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1∶2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1∶2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1∶2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1∶4、1∶8、1∶4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10～100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。     

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。     

应用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒

取０．５ｍｌ兔ＢＨＫ－２１新鲜健康细胞液和０．１ｍｌ狂犬病病毒细胞液在含小飞片青瓶中混合，培养２４小时后制片，加抗狂犬病病毒兔抗体感作，用抗逸荧光抗体染色，通过荧光显微镜观察细胞浆内黄绿芭一病毒是否在细胞内增殖，从而建立了检测狂犬病病毒的间接免疫荧光法。     

测定狂犬病病毒中和抗体的微量免疫酶试验

在Kazuakz等报道的微量免疫酶技术(MIET)的基础上,以健康细胞对照孔OD值均数加3倍标准差作为间接ELISA判定标准,进而建立了求中和剂量的新方法.通过用中和99%病毒的一致判定标准同经典的小鼠中和试验(MNT)比较看,本试验所建立的方法可代替MNT.