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以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。 相似文献
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根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ (DNase Ⅱ)基因设计引物,通过RT-PCR 扩增出鼠DNase Ⅱα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109.经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNase Ⅱα基因序列完全一致,大小为1 008 bp.将重组质粒pMD-DNase Ⅱα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定.结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNase Ⅱα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应. 相似文献
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旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因的筛选与分析 总被引:1,自引:1,他引:0
筛选旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因。利用λZAP载体构建旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库。用感染旋毛虫26 d猪血清对其进行免疫学筛选,对筛选出的阳性克隆进行测序与分析;应用RT-PCR方法对编码p46 000蛋白强阳性克隆基因在不同发育时期虫体转录情况进行检测。成功构建了旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库,其库容量为1.5×106pfu,重组率为95%,插入片段在400 bp~2 000 bp之间,扩增后文库滴度为1.5×1012pfu/mL。筛选出阳性克隆33个,序列分析表明,有20个克隆为同一已知基因,称为旋毛虫p46 000蛋白,编码旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂,且在筛选过程中反应信号均较强;还发现了一些旋毛虫新基因,如编码Ubc蛋白,GM13181蛋白,Rieske硫铁蛋白1等。本研究获得了一个高丰度、反应原性较强抗原基因,其编码蛋白为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 相似文献
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牛肉中阿苯达唑及其代谢产物残留的检测 总被引:2,自引:0,他引:2
阿苯达唑是一种广谱抗蠕虫药,但是由于用药不当等原因,其在动物可食性组织中的残留可能刺激神经系统及消化系统、触发过敏反应甚至出现肝功能异常。本试验基于5μg/kg的检验限建立牛肉中的阿苯达唑及其代谢产物的检测方法——高效液相色谱法。样品中残留的阿苯达唑及其主要代谢产物阿苯达唑砜和阿苯达唑亚砜,经乙醚提取,乙腈和己烷萃取,由高效液相色谱(配紫外检测器)测定得到阿苯达唑及其亚砜与砜的平均回收率分别为71.8%~88.6%、78.1%~85.6%和83.1%~91.9%,变异系数分别为2.8%~9.2%、0.9%~4.9%和1.4%~4.8%。 相似文献
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[目的 ]筛选出"消化法"检测旋毛虫病的最适检测条件,即消化后收集虫体所需要的沉降温度和沉降时间,为改善现有屠宰动物旋毛虫病"消化法"检验技术提供重要的参考数据。[方法 ]将12个旋毛虫国际标准虫株(8个种和4个基因型)感染Balb/c小鼠,感染40天后剖杀,分别在4℃和25℃条件下计算不同时间点的回收肌幼虫百分比,计算不同温度不同时间点收集到的肌幼虫数目与消化液原液总的肌幼虫数目的比值及沉降速率。[结果 ]比较发现旋毛虫不同种及基因型在不同温度和沉降时间上回收的肌幼虫百分比存在明显差异,确定出适合已知旋毛虫每个种和基因型的消化法检验最适条件,筛选出最适条件为4℃沉淀、至少沉降45分钟。[结论 ]现有消化法检验旋毛虫病的国际"金标准"确实存在一定的偏差和不足,在实际应用中有可能造成旋毛虫病的漏检。本研究结果筛选出适合消化法检验旋毛虫病的最适条件,为进一步完善消化法检测旋毛虫病的国际"金标准"提供参考。 相似文献