池塘养殖尾水经稻田生态工程净化后的浮游细菌群落特征

为利用稻田生态工程对精养池塘尾水进行循环利用,采用Illumina Mi Seq第二代测序技术比较分析了稻田生态工程进出水中浮游细菌群落结构和多样性差异,以探讨稻田生态工程净化回用水中浮游细菌群落变化对池塘养殖的影响。结果显示,稻田生态工程进出水中优势浮游细菌在门水平上的组成相同,均为蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。但优势门类的相对丰度发生变化,蓝细菌门的相对丰度由进水中的46.72%显著降低至表面流出水中的41.82%和渗流出水中的34.77%;而放线菌门的相对丰度由3.90%增加至表面流出水中的5.65%和渗流出水中的6.45%。属水平上优势浮游细菌组成也相同,但微囊藻属(Microcystis)的相对丰度由0.83%显著降低至渗流出水中的0.46%(P0.05)。另外,稻田生态工程表面流出水中浮游细菌物种丰富度指数(Chao 1)显著提高,渗流出水中Shannon多样性指数显著提高,且Simpson指数显著降低(P0.05)。     

应用高通量测序技术分析拟穴青蟹肠道及其养殖环境菌群结构

采用基于Illumina Hi Seq测序平台的高通量测序技术,对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)肠道及其养殖池塘水体、底泥中细菌种类及丰度进行了研究。测序结果显示,3个样品共获得有效序列234575条,可聚类于2812个分类操作单元(OTUs),归属于拟穴青蟹肠道、养殖水体、池塘底泥样品的操作分类单元(OTU)个数分别为453、706和2547,其中有184个OTU均能在3个样品中检测到,在青蟹肠道和养殖水体、青蟹肠道和池塘底泥中分别检测到197和309个共有OTU。物种注释结果显示,拟穴青蟹肠道中优势细菌种类为变形菌门(Proteobacteria)(39.96%)、柔膜菌门(Tenericutes)(23.09%)和厚壁菌门(Firmicutes)(16.58%);养殖水体中优势细菌种类为变形菌门(63.02%)、放线菌门(Actinobacteria)(24.96%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(8.41%);池塘底泥中优势细菌种类为变形菌门(75.23%)、拟杆菌门(5.72%)和放线菌门(3.83%)。此外,对各样品中丰度最高的前10位OTU分析显示,不同样品中占优势地位的10种细菌在数据库(SILVA)缺乏相关已知序列,并且各样品中的优势细菌种类完全不同。实验结果表明拟穴青蟹肠道与其池塘养殖环境中菌群结构存在着密切的相关性,但肠道菌群同时具有一定的独立性,其优势细菌种类与养殖环境中优势细菌种类无关。本研究旨在为拟穴青蟹健康养殖和微生态调控提供实验依据。     

基于病毒宏基因组技术侦测牡蛎体内病毒

建立了牡蛎(Crassostrea spp.)病毒宏基因组研究方法,应用差速离心和蔗糖垫超速离心提取病毒样颗粒,核酸酶处理宿主游离核酸后提取病毒总核酸,经反转录、双链合成和核酸扩增获得足量DNA。高通量测序共获得1 661 809 000个碱基,包括6 647 236个读长(reads)信息,拼接后得到50 842个重叠群(contig),序列总长度达到14 239 389 bp。同时从reads质控图等多方面对测序数据进行分析与评估,显示测序数据质量良好。数据与病毒库进行比对,发现病毒序列来自于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)2个科,类单纯疱疹病毒(Simplexvirus)、心病毒(Cardiovirus)和肠道病毒(Enterovirus)3个病毒属。     

铺地木蓝对肇庆地区柑橘园土壤养分及细菌群落的影响

【目的】探究铺地木蓝在柑橘果园种植 1 年后对杂草、0~20 cm 土层土壤养分含量和土壤细菌多样性的影响。【方法】设置自然生草（CK1）、土壤覆盖遮草布（PD1）、土壤覆盖银黑地膜 + 种植铺地木蓝（PD2）、种植铺地木蓝（PD3）4 个处理,1 年后调查杂草种类、测定土壤理化性质（pH、有机质、全氮、碱解氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾）和土壤细菌群落情况。【结果】 PD2 处理土壤全氮（0.86 mg/g）、全磷（0.78 g/kg）、速效磷（23.84 mg/kg ）、全钾（11.91 g/kg）、有机质（34.82 g/kg）含量最高;PD2 处理土壤全氮和碱解氮含量比 PD1处理的分别增加了 0.37、27.43 mg/kg,PD1 处理土壤全磷含量最低（0.41 g/kg）,PD3 处理速效磷（10.67 mg/kg）和有机质（25.99 g/kg）含量最低;PD1~PD3 处理的土壤全钾含量均大于 CK1 处理,速效钾含量则相反;杂草调查结果表明 PD1、PD2 处理均可很好地抑制杂草的生长。与 CK1 相比,PD1~PD3 处理均可降低土壤细菌群落多样性,但不影响细菌群落分布均匀性。PD2 和 PD3 处理的土壤细菌群落结构和丰度较相似,表现为变形菌门（Proteobacteria）相对丰度降低,绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、罗库菌门（Rokubacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等有益细菌的相对丰度增加;其中 PD2 处理的优势菌属为 MND1（3.47%）、Sh765B-TzT-35（4.37%）,PD3 处理的优势菌属为 MND1（4.29%）。从 PD1 处理土壤中检测到视为土壤环境恶化的标志类群异常球菌 - 栖热菌门（5.10%）。【结论】柑橘果园行间道覆盖地膜后再种植铺地木蓝的综合表现最好,可以增加土壤养分和土壤中有益细菌群落的相对丰度。     

斑点叉尾鮰养殖池塘底泥微生物群落结构特征及其影响因素

微生物群落在水产养殖环境中起着重要作用,深入了解微生物群落组成及其构建机制对了解池塘生态功能具有重要意义。本研究通过高通量测序技术研究斑点叉尾鮰（）养殖池塘底泥中细菌群落机构特征,并分析了细菌群落的主要影响因素。结果显示,斑点叉尾鮰养殖池塘底泥细菌群落结构呈现出季节性变化,冬春季样品相似性较高。斑点叉尾鮰养殖池塘底泥优势菌群主要为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和酸杆菌门（Acidobacteria）,与池塘水体细菌群落间有明显的差别。线性判别分析显示,冬、春和秋季的特异性优势菌群较为丰富,冬季和春季分布较为集中,分别集中于浮霉菌、拟杆菌门、绿弯菌门和厚壁菌门、拟杆菌门,秋季特异性优势菌群分布特别分散,而夏季优势细菌类群最少,只有绿弯菌门厌氧绳菌属1个属具有显著优势。环境因子中,透明度和总溶解性悬浮物与斑点叉尾鮰养殖池塘底泥细菌群落结构有显著相关（<0.05）,对细菌群落结构的影响也最大。本研究旨为斑点叉尾鮰池塘微生物群落的变化和调控提供借鉴。     

醉鱼糟制过程中酒糟液中的微生物群落

为探讨醉鱼糟制过程中酒糟液微生物群落多样性,本实验以大黄鱼为原料,用传统糟制工艺制作醉鱼,采用Illumina HiSeq2500高通量测序技术对醉鱼酒糟液菌群进行分析。结果显示,糟制过程中不同用盐量(2%、5%和10%)大黄鱼pH值在糟制前5 d或10 d稍有上升后逐渐降低,而TVB-N值在糟制期间逐渐下降,糟制30 d后的TVB-N值均低于30 mg/100 g,其中5%用盐量组最低;5%用盐量组在不同鱼糟比(1:1、1:1.5和1:2)下,大黄鱼pH和TVB-N值变化规律基本一致,说明糟制过程中醉鱼品质较稳定。5%用盐量组醉鱼酒糟液微生物高通量测序结果显示,鱼糟比为1:2的酒糟液Chao指数最大(167),表明物种丰度最高;鱼糟比为1:1的酒糟液Shannon指数最大(2.75),Simpson指数最小(0.109),表明细菌多样性最高;酒糟液涉及细菌17个门和1个未分类菌门,143个属,变形菌门、蓝细菌门和厚壁菌门是优势菌门,其中变形菌门占绝对优势;弧菌属、Chloroplast norank和肠杆菌属是优势菌属,发酵前期弧菌属占绝对优势。研究结果为醉鱼酒糟液微生物群落多样性研究提供理论依据,为控制糟制水产品卫生安全提供参考。     

基于RAD-seq技术的长体圆鲹二、三核苷酸重复微卫星标记开发与评价

通过对长体圆鲹(Decapterus macrosoma)基因组进行RAD-Seq高通量测序,共获得58 180条微卫星序列,选取112条二、三核苷酸重复的微卫星序列设计引物,经筛选后,共获得27个具有多态性的微卫星标记。利用一个长体圆鲹群体对通过筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。结果显示,27对引物扩增的序列中18个位点为二核苷酸重复,重复次数为9~14次,9个位点为三核苷酸重复,重复次数为6~10次,等位基因数(Na)为5~17 (平均10.6),表观杂合度(Ho)为0.342 9~0.857 1 (平均0.631 7),期望杂合度(He)为0.538 3~0.911 8(平均0.796 8),多肽信息含量(PIC)为0.497~0.886 (平均0.780 9),除1个位点外,其他位点PIC值均大于0.500,表明开发的微卫星位点具有较高的多态性。"哈迪-温伯格"平衡(HWE)检测结果显示,19个标记等位基因频率符合HWE。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。该研究开发的27个微卫星标记可为长体圆鲹种群遗传学研究提供基础。     

6 个不同品种荔枝果肉内生细菌群落多样性的高通量测序分析

【目的】内生菌在植物生长发育中发挥重要作用,分析不同品种荔枝果肉内生细菌群落结构及多样性,挖掘和利用潜在荔枝内生菌种资源,为进一步研究荔枝与内生菌互作关系提供参考依据。【方法】以 6 个不同品种荔枝的果肉组织为材料,PCR 扩增 16S rDNA 的 V3~V4 区,利用 MiSeq 高通量测序技术分析果肉组织内生细菌在门、科、属和种分类水平上的群落组成及优势菌群,结合 Alpha 多样性分析评估内生细菌群落多样性。【结果】对 6 个品种荔枝果肉内生细菌 16S rDNA 的 V3~V4 区进行扩增,共获得 2 139 086 条序列,其平均长度为 376 bp。不同品种荔枝果肉内生细菌群落在相对丰度和多样性上无显著差异。在门分类水平,变形菌门为主要优势细菌门类,其次为放线菌门。在科、属和种分类水平上,不同品种荔枝内生菌群落结构相似,但相对丰度占比不同。差异菌群分析结果显示,假单胞菌属（Pseudomonas）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和迪基氏菌属（Dickeya) 在优良品种‘鹅蛋荔’‘糯米糍’和‘观音绿’中显著富集,根瘤菌属（Bradyrhizobium）和变形菌属（Snodgrassella）只在‘鹅蛋荔’中富集。根据菌群相对丰度进行聚类分析,‘观音绿’‘糯米糍’和‘鹅蛋荔’的相似性更高。Alpha 多样性分析结果表明,6 种荔枝果肉内生菌群仅在丰度和多样性上存在差异,但未达到显著水平。【结论】该研究首次分析了 6 个不同品种荔枝果肉内生细菌的群落结构,并在优良荔枝品种中发现特有的微 生物类群富集现象,可为后续提升荔枝品质、开发利用内生菌提供理论依据和重要参考。     

温度对拟穴青蟹循环水养殖系统微生物群落结构的影响

为探究温度对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)循环养殖水体中微生物群落的影响,深入理解环境因子与养殖水体微生物群落之间的相关性。在水温分别为18℃、22℃、26℃、30℃和32℃的循环养殖系统中进行拟穴青蟹养殖,采用16S rRNA高通量测序技术对不同温度下的养殖水体微生物群落组成进行分析。结果表明:(1) Alpha多样性指数显示5组水样中细菌群落多样性指数大小为t26t22t30t32t18,物种丰度大小为t22t26t32t30t18。温度可以导致养殖水体中微生物群落多样性发生变化,但并未发现二者之间直接的相关性。(2) 5种温度下的养殖系统中细菌群落共有31门、43纲、94目、185科和351属,变形菌门(Proteobacteria)为循环养殖水体中绝对优势菌门。在养殖系统水温为26℃时,养殖水体中氮磷污染物含量相对较高,其水中脱氮除磷菌属的相对丰度也显著高于其他4组。(3)由花瓣图和UPGMA聚类分析图进行相似性分析可知,水体微生物群落对温度的变化有着良好的响应, 5组水样的细菌群落结构总体相似性较低,其中最高温度32℃和最低温度18℃的水体中细菌群落结构最为相似。(4)水体中微生物群落结构和与环境因子的相关性分析显示,氮磷营养盐中的总磷(TP)和硝酸盐(NO3–-N)对水中微生物群落特征具有显著性影响,而温度是导致养殖水体中氮磷营养盐差异化的主要原因。上述研究结果初步解释了温度对拟穴青蟹循环养殖水微生物群落的作用机制,为下一步深入研究拟穴青蟹循环水养殖系统中环境变化与微生物的相互关系提供参考。     

高通量测序解析冰鲜刀鲚细菌群落变化特征

为了研究养殖刀鲚冰鲜保存过程中细菌群落组成及变化情况,采用Illumina Miseq 高通量测序方法对冰鲜条件不同贮藏时间（0、3、6、9、12、15、18 d）刀鲚肌肉样本细菌的16S rRNA基因的2个高变区（V3—V4）进行测序,比较其细菌多样性及门、属水平的细菌相对丰度,并进行主成分分析、Heatmap分析以及特定腐败菌分析。结果显示,7组样品细菌分布于40 门787属,冰鲜条件下刀鲚肌肉的优势致腐败菌属为假单胞菌、微杆菌属和气单胞菌属。主成分分析显示,刀鲚腐败前后的微生物结构存在差异。Heatmap图分析显示新鲜样本的细菌丰度最大。3组冰鲜贮藏6 d前的样品群落结构较相似。贮藏12 d时常见致腐菌（微杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属）占比显著提高,其细菌的多样性及丰富度最低。随着冰鲜保存时间的延长,刀鲚肌肉的细菌菌落结构产生了动态变化。冰鲜保存6～9 d后刀鲚肌肉的细菌菌落结构变化较大,研究结果可以为预测冰鲜刀鲚货架期提供参考。