渭南地区奶牛养殖场生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染状况的调查

【目的】对渭南地区奶牛养殖场生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况进行调查,为保障生鲜牛乳卫生和食用安全提供基础资料。【方法】在渭南市部分奶牛养殖场进行乳样采集,以项目团队建立的金黄色葡萄球菌的A型肠毒素(SEA)、β-内酰胺酶(BLAZ)和耐热核酸酶(NUC)基因的三重PCR方法检测样品中的金黄色葡萄球菌,对阳性样品进行细菌分离;在奶牛养殖场分别调查牛场性质、环境卫生、挤奶前的准备工作、挤奶方式与生鲜奶盛装运输等工作,结合乳样中金黄色葡萄球菌的检出情况,分析以上因素对乳中金黄色葡萄球菌污染的影响。【结果】在14个奶牛养殖场,分7次收集生鲜乳样98份,PCR检测发现金黄色葡萄球菌阳性乳样10份,阳性率10.20%(10/98),其中BLAZ基因阳性样品7份,阳性率7.14%(7/98),SEA基因阳性8份,阳性率8.16%(8/98)。在4个养殖场的乳样中检测到金黄色葡萄球菌,7次采样样品中,金黄色葡萄球菌检测1次阳性的有1个场,2次阳性的2个场,5次阳性的1个场。对这4个养殖场基本情况调查发现,均为家庭小规模养殖(奶牛头数6～9头),挤如后对鲜乳混合后进行零售;5次检测为阳性的牛场存在奶牛与其他动物混养、手工挤奶、挤乳前未对双手和牛乳房进行充分清洗和消毒。【结论】渭南地区奶牛养殖场生鲜牛乳的金黄色葡萄球菌污染率较低,造成金黄色葡萄球菌污染与奶牛养殖环境、挤乳前的消毒工作、挤乳方式密切相关,良好的养殖环境和挤乳方式将大大降低金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染。     

太白蓼提取物体外抑制新城疫病毒及5种细菌的活性部位筛选

【目的】筛选太白蓼提取物抑制新城疫病毒(NDV)及5种细菌的活性部位。【方法】采用细胞病变法和MTT法测定太白蓼提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖的影响,并用琼脂扩散和试管稀释法进行了抑菌试验。【结果】太白蓼乙酸乙酯部位(PTKE)及其分离物EB,对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的抑制率分别为32.49%和66.31%(P<0.01);分离物EB药毒混合感作组对NDV的抑制率显著高于先给药后接毒组和先接毒后给药组(P<0.01),质量浓度在78.13μg/L以下时,先给药后接毒组对NDV的抑制率显著高于先接毒后给药组(P<0.01),当质量浓度为156.3μg/L以上时,2组间差异不显著(P>0.05),药物质量浓度与病毒抑制率间存在明显的量效关系(P<0.05)。PTKE对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和无乳链球菌的最低杀菌浓度(MBC)分别为100,25,50,25和50 mg/mL;而PTKE的分离物EA、EB和EC对大肠埃希菌和巴氏杆菌无抑菌作用,EA对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的MBC分别为2.5和5.0 mg/mL,EB对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和无乳链球菌的MBC分别为1.25,5.0和2.5 mg/mL,EC对金黄色葡萄球菌的MBC为2.5 mg/mL。【结论】太白蓼提取物具有体外抑制NDV和细菌的作用。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

奶牛隐性乳房炎的调查分析

采用体细胞计数(SCC)法对杨凌某奶牛场中60头不同胎次和泌乳时间奶牛隐性乳房炎进行检测,对引起乳房炎的可能诱因进行调查分析,研究该场奶牛隐性乳房炎的发病规律,为本病的防控提供参考。结果表明,受检奶牛隐性乳房炎的检出率为43.3%。1胎～2胎奶牛隐性乳房炎检出率为40.0%,3胎～4胎为46.7%,隐性乳房炎的检出率有随胎次增加而升高的趋势;泌乳时间少于200 d的泌乳牛隐性乳房炎检出率为27.6%,200 d～300 d的为36.4%,300 d～400 d的为41.7%,超过400 d的为50.0%,提示奶牛隐性乳房炎有随泌乳期升高的趋势。本调查显示,奶牛隐性乳房炎的发生与胎次和泌乳时间有显著的相关性,饲养管理和卫生条件是乳房炎发生的重要诱因。     

鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究

 【目的】探索鸡气管上皮细胞（chicken trachea epithelium,CTE）分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBV M41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84 h后产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。     

增益素对鸡细胞免疫功能的影响

给8周龄鸡人工感染传染性法氏囊病病毒(IBDV),破坏鸡的法氏囊器官,从而造成鸡的免疫缺陷。在9周龄时,实验组1饲喂增益素,实验组2接种鸡新城疫(ND)油乳剂疫苗,通过测定淋巴细胞转化率来监测细胞免疫效果。结果表明,饲喂过增益素的鸡外周血T淋巴细胞活化指数增加的百分数高于仅接种ND疫苗的鸡(P<0.01),说明增益素对感染了传染性法氏囊病病毒的鸡细胞免疫有增强作用。     

鸡气管黏膜上皮基底细胞的分选与鉴定研究

鸡气管黏膜上皮细胞是IBV和其他禽病原体感染的重要靶细胞。气管黏膜上皮细胞种类多样,不同细胞对病原感染敏感性有差异,研究与比较IBV感染不同种类气管黏膜上皮细胞特性有助于弄清IBV分子感染机制。利用流式细胞仪技术,使用基底细胞特异性抗体从鸡气管黏膜上皮细胞中分选出基底细胞。通过基底细胞培养形态的观察、生长曲线的绘制和特异性免疫荧光的鉴定,成功获得能够稳定生长繁殖的高纯度的鸡气管黏膜基底细胞,为今后IBV或其他相关研究奠定技术基础和提供了良好的种子细胞。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...     

转录靶向猪瘟病毒3′-UTR shRNA细胞株干扰猪瘟病毒增殖的检测

对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因,以研究构建细胞株在转录水平上对CSFV增殖干扰的效果;接毒后第72、96和148小时以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞NS3蛋白表达量,通过OD490值分析构建细胞株在病毒蛋白表达水平上对CSFV增殖的影响。检测结果表明：（1）接毒后第72和96小时P-1、P-2和P-3细胞株中NS3基因的量明显减少,与接毒的空白PK-15细胞比较差异显著（P〈0.05）,说明P-1、P-2和P-3细胞株转录的shRNA能干扰CSFV RNA的转录;（2）接毒后第72和96小时P-1、P-2、P-3细胞株中NS3蛋白的表达量明显少于接毒的PK-15细胞（P〈0.05）,说明转录的shRNA在病毒蛋白水平上能干扰CSFVNS3基因的表达,但接毒后第148小时干扰效果有所降低。     

PCV2感染猪各组织病毒载量与细胞内质网应激和自噬相关性

通过对PCV2阳性猪剖检,采集了心脏、肝脏、肾脏、肺脏、肾脏、大脑、肠、胃等组织样品,使用定量PCR(qPCR)对PCV2衣壳蛋白Cap基因、ERS和自噬标志基因进行定量分析。结果显示,肺脏中PCV2载量最高,其次为肝脏和肾脏含有较多病毒,小肠、心脏与大脑中病毒载量较少,胃内并未检测到PCV2。ERS和自噬在肺脏中发生最多,其次为小肠,再次为肝脏和肾脏,ERS和自噬水平较高,心脏与大脑中仅发生少量ERS与自噬,而在胃中几乎没有发生。通过透射电子显微镜观察心脏、肝脏、肾脏、肺脏、大脑、肠等组织样品。观察结果显示,所有器官中均可观察到PCV2感染,除肺脏内含量较多外其余各组织中差异不大。各组织中均可见不同数量的自噬小体与内质网应激,其中以肺脏内数量最多,其次为肠道,其余各组织中数量差异不大。电镜观察结果与qPCR检测结果一致,肺脏为病毒载量最大的器官同时也是ERS与自噬发生最多的器官,胃中几乎无病毒感染同时也几乎没有ERS与自噬发生。试验结果表明,除了小肠以外的各组织中ERS与自噬发生情况均与PCV2载量成正相关。为深入研究PCV2诱导细胞ERS和自噬的机制提供了新的理论依据。