陆地棉CC-NBS-LRR基因的克隆及特征分析

根据抗病基因核苷酸结合位点(Nuc leotide b ind ing site,NBS)设计简并性引物,从陆地棉cDNA中进行RT-PCR扩增。获得含NBS保守域的EST,进一步用RACE技术和TAIL PCR技术获得其中1个EST的全长基因序列,并获得GHNBS基因的5′调控序列。此基因被命名为GHNBS。该基因的编码区长2 583 bp,编码861个氨基酸,GHNBS编码的氨基酸序列与拟南芥R基因具有28%的同源性。GHNBS与拟南芥的其他几个NBS-LRR基因比较发现,它们在保守区外的相似性相当低。Southern杂交和网上数据库搜索分析都表明GHNBS是1个寡拷贝基因。通过半定量RT-PCR分析发现GHNBS在棉花的蕾、花瓣、韧皮部、根及叶中均有表达且在根、叶中表达量比其它部位强,在木质部基本不表达。     

高品质棉主要农艺性状及经济性状的杂种优势

选用3个通过种间杂交后代选育的棉花高品质系(种)与4个抗棉铃虫棉花品种(系),按3×4不完全双列杂交设计,配置24个F1组合.对杂种一代主要农艺、经济和纤维品质性状进行杂种优势及遗传分析.结果表明:F1籽、皮棉产量具有一定的中亲优势,竞争优势差,其遗传以加性效应为主,其次为显性效应;铃重F1优势明显,无论中亲优势、超亲优势、竞争优势均有一定的正向优势,其遗传以显性效应为主,其次是加性效应;结铃数和衣分多表现为负优势,其遗传以加性效应为主,结铃数无显性效应;h2B和h2N均以衣分最高,分别为74.5%和85.9%,皮棉产量其次,分别为60.2%和70.2%,结铃数最低,均为 13.1%;纤维品质性状优势明显,尤以竞争优势表现突出,其遗传以加性效应为主,其次为显性效应.     

草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得

以从大青山草地早熟禾、超级伊克利和午夜等3个草地早熟禾品种的成熟种子诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织为受体材料,应用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶基因(GO)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)的重组质粒导入草地早熟禾。愈伤组织经携带pBGO质粒的农杆菌LBA4404的感染和共培养后,转到添加筛选剂G-418 20~50 mg/L的愈伤组织继代培养基上进行筛选,选择对卡那霉素具有抗性的愈伤组织,进而获得再生植株。试管植株的叶片经淀粉-碘化钾显色反应后,检测到转基因植株中产生了过氧化氢。PCR分子检测证明,GO基因已整合到转化植株的基因组中。抗病性鉴定结果显示,转GO基因植株对水稻纹枯病具有不同程度的抗性。     

棉花CLE多肽家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

【目的】CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)多肽是一类小分子分泌蛋白,在植物生长发育过程中,对于维持分生组织细胞增殖与分化间的平衡起到重要的信号转导和调控作用。CLE家族是迄今为止报道的最大的植物多肽分子家族,也是近十年来研究最为热门的植物多肽激素。尽管CLE基因家族在拟南芥和水稻等模式植物中取得较多的研究进展,但在棉花中有关CLE多肽基因家族的研究尚属空白。通过对CLE多肽家族的鉴定及演化研究,可以为进一步挖掘棉花中的功能多肽及其信号转导研究提供一定的理论基础。【方法】本文以亚洲棉(Gossypium arboreum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、陆地棉(G. hirsutum L.)和海岛棉(G. barbadense L.)为研究对象,利用生物信息学方法和已鉴定的拟南芥CLE基因序列,在棉花基因组中进行同源比对,并对4个棉种中的CLE家族成员进行全基因组鉴定和分析。【结果】共得到148个棉花CLE候选基因。陆地棉和海岛棉中CLE基因数量都分别是亚洲棉和雷蒙德氏棉的2倍。聚类分析将所有CLE基因分为5个亚组。Ka/Ks分析表明大部分基因都经历了负选择作用,有11对基因经历了显著的正选择作用。转录组数据分析发现,除海岛棉中的Gb CLE39、GbCLE13、GbCLE43,陆地棉中Gh CLE34、Gh CLE9以及亚组棉中的GaCLE4外,大部分CLE基因在棉花组织中的表达量较低,这与多肽在植物体内含量较低相一致。CLE核心保守基序分析发现了12个棉花特有的多肽,其中有2个多肽来源于受到强烈正选择作用的基因,因此在后续研究中可以对其进行进一步深入分析。【结论】本文利用生物信息学、比较基因组学等方法,首次对棉花的CLE基因家族进行了鉴定和分析,对于进一步挖掘棉花中的功能多肽及其信号调控网络研究提供了一定的理论基础。     

转GbVe1基因在棉花基因组中的整合与定位分析

【目的】明确转GbVe1基因棉花的插入位点序列特征。【方法】Southern杂交筛选低拷贝基因插入的转基因棉花株系,以hiTAIL-PCR(Polymerase chain reaction)获取其T-DNA侧翼序列,然后根据获得的T-DNA侧翼序列设计特异PCR引物,验证插入位点的准确性。【结果】Southern杂交候选了T-DNA低拷贝插入的3个转基因棉花株系,hiTAIL-PCR分离到RB端侧翼序列(119~1 018 bp)、LB端侧翼序列(243~516 bp);侧翼序列的AT碱基含量在63%以上。转基因株系7/100826-152和12/100826-393插入位点都位于Gohir.D01G157600.1内含子上。转基因株系1/w-ch14插入位点分别位于Gohir.D01G157600.1内含子和A12染色体的基因间隔区中。T-DNA在Gohir.D01G157600.1内含子的插入事件造成了21 bp碱基的基因组序列缺失。T-DNA到侧翼序列的PCR产物证明Gohir.D01G157600.1上的插入位点真实可靠。【结论】hiTAIL-PCR获取了转GbVe1基因棉花的T-DNA侧翼序列,提供了T-DNA插入位点位于Gohir.D01G157600.1基因内含子的特异性检测引物。     

海岛棉的一个富含亮氨酸重复受体蛋白基因的克隆和功能分析

通过染色体步移获得了海岛棉的一个受体蛋白基因Gb Vdr1,其开放阅读框为3 387个核苷酸,编码1 128个氨基酸,编码蛋白分子量为1.249×105,等电点为5.86。Gb Vdr1与陆地棉抗病材料常抗棉和感病材料渝棉1号中的同源基因Gh Vdr1和Gh Vdr1-1的相似度高达99.85%。Gbvdr1具有信号肽、跨膜区、LRR重复区、蛋白质降解相关的PEST结构域以及内吞信号。Gb Vdr1在根茎中的表达量高于叶片,其对非落叶型黄萎病菌株BP2的反应较落叶型菌株V991的更为强烈,并且这种差异在茎和根中更为明显。Gb Vdr1定位于细胞膜上。PCR鉴定共获得Gb Vdr1过表达转基因株系23株,对目的基因表达量最高的株系进行黄萎病抗性鉴定,结果表明转基因株系对BP2的抗性显著增强,但是对V991没有抗性。转基因株系接种黄萎病后防卫反应(PR)相关基因PR1、PR5、EDS1以及GST1的表达量较野生型显著增加。对于Gb Vdr1的功能分析结果表明其参与了棉花对BP2的抗性反应。     

一个受TYLCV诱导上调表达的番茄基因LeFLS2的功能分析

为了分析番茄鞭毛蛋白受体基因(LeFLS2)的功能,构建了LeFLS2的进化树,通过RNA-seq方法研究LeFLS2基因在番茄植株受番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染时的响应情况,并通过荧光定量PCR对LeFLS2在番茄各个发育组织器官的表达量进行分析,进一步通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术在番茄中沉默LeFLS2,对沉默植株接种TYLCV以及丁香假单胞菌番茄变种DC3000进行抗病性鉴定,并对沉默植株的表型进行观察。结果表明,LeFLS2基因与另外一个相似性达到83%的另一个番茄LeFLS2-2基因在一个独立分支上;受TYLCV侵染后LeFLS2基因上调表达;LeFLS2在番茄植株的各个组织器官中均表达,在根中表达量最高,在新叶中表达量最低;沉默LeFLS2后对TYLCV的抗性变化不大,而对DC3000的感病性增强,沉默植株比野生型植株生长明显加快。说明LeFLS2基因对抵抗细菌DC3000侵染以及番茄的生长发育起到重要作用。     

陆地棉NF-YB基因家族的全基因组分析

为了进一步了解NF-YB基因家族结构的功能,利用生物信息学手段,系统研究了陆地棉标准系TM-1基因组中NF-YB基因家族的数目、亚细胞定位、染色体分布、进化关系、基序以及组织表达情况。结果表明:TM-1基因组中共有41个NF-YB基因家族成员,它们含有相同的CBFD_NFYB_HMF结构域,大部分定位到细胞核内;41个NF-YB基因家族成员分布在19条染色体上,其中有19组成员在A亚组和D亚组中表现为直系同源基因;进化树分为Ⅰ和Ⅱ2个小组,每个小组成员间具有相似的基序类型和排列顺序;组织表达分析则发现,在这41个NF-YB基因家族成员中,至少有24个成员可以进行表达,且表现出一定的组织特异性。     

间作及几种物理防治对番茄黄化曲叶病毒病的防控效果

番茄黄化曲叶病毒病(TYLCVD)是以烟粉虱为传播媒介的病毒病,该病害的暴发直接导致番茄毁灭性绝产.从控制传播媒介烟粉虱种群数量着手,用黄板监测烟粉虱种群数量的变化,探讨了设置防虫网、铺设地膜、间种黄瓜、棚体覆盖紫外吸收膜等处理对烟粉虱种群数量的防控效果.采用平行跳跃式5点取样方法统计数据,采用SAS 9.1对数据进行统计,利用极差分析法对试验中涉及的影响因素进行分析.结果表明,设置防虫网处理较无防虫网处理烟粉虱种群数量少33.41％.铺设黑白地膜、银黑地膜对烟粉虱种群数量和番茄黄化曲叶病毒病有较好的防控效果,黑白地膜、银黑地膜较黑色地膜烟粉虱数量分别少54.50％、50.55％.统计后期覆盖防虫网、黑白地膜处理的发病率最低,为8.18％.间种黄瓜对烟粉虱的种群数量无显著影响,间作黄瓜处理下铺设黑白地膜发病率仅为8.05％,而铺设黑色地膜发病率达11.25％.影响TYLCVD发病的物理因素的主次顺序依次为:地膜、防虫网、黄瓜,最优组合为铺设黑白地膜、设置防虫网、间种黄瓜.覆盖紫外吸收膜较覆盖普通PVC膜烟粉虱种群数量少37.13％,紫外吸收膜处理下铺设银黑地膜田块发病率最低,为9.85％.大棚覆盖PVC膜,铺设不同地膜时,黄板监测统计的烟粉虱种群数量显示挂置2～9d时诱集的烟粉虱种群数量上升幅度最大,诱集烟粉虱成虫数量由少至多依次为黑白地膜、银黑地膜、透明地膜、无地膜、黑色地膜.     

棉花MYB转录因子基因GbMYB5的克隆及表达分析

在对陆地棉Maxxa BAC文库所获得的一个BAC克隆进行测序分析过程中,发现一个新的MYB类转录因子,为探明其在棉花中的表达模式,采用RT-PCR技术从海岛棉品种H7124中克隆出该基因,命名为GbMYB5(GenBank登录号为:JF820389)。GbMYB5基因全长1 105 bp,编码277个氨基酸。RT-PCR结果表明GbMYB5基因在棉花的茎、叶、蕾、絮和未成熟的种子中均有表达,尤以叶片中的表达水平最高。重金属胁迫可短暂抑制GbMYB5基因表达,但表达量在处理48 h后回升到正常水平。PEG、脱落酸和赤霉酸诱导均可增强GbMYB5基因的表达。另外,构建了含有GbMYB5基因全长的植物过量表达载体,转化烟草。经PCR检测获得目的基因正常表达的转基因烟草9株,为研究该基因的抗逆作用奠定了基础。