Bt cry序列本地数据库的建立及本地BLAST的实现

根据研究的实际需要,运用winSDK设计了一个可视化的BLAST接口程序,利用此程序可以构建本地核酸和蛋白序列数据库与进行本地BLAST。在此基础上建立了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry基因的本地核酸序列数据库,并进行了本地BLAST。与先前文献中介绍的本地BLAST实现的方法相比,此方法操作简便、并可根据实际需要随意定制相关数据库;在与NCBI的BLAST进行比较后发现,本地BLAST还具有个性化、准确性强、可信度高等特点。     

对鞘翅目害虫高毒力Bt基因cry3Aa7的分离克隆及表达研究

从国内分离的对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的Bt菌株中克隆了3.0kbcry3Aα基因大片段,完成了该片段的亚克隆和全序列测定,该基因编码区为1932bps,编码的蛋白质由644个氨基酸残基组成,分子量73.1ku,等电点为pH5.165,为弱酸性蛋白,该蛋白中Ser,Leu,Thr含量最高,分别为8.22%,8.07%和7.76%,通过穿梭载体将该基因导入Bt无晶体突变株中,获得工程菌Biot205,cry3Aα7基因在其中能正常表达,并形成扁方形晶体。工程菌Biot205对榆蓝叶甲（Pyrrhalta aenescens)校正死亡率为86.21%。该基因序列已在EMBL、GenBank中登记,并被国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会正式命名为cry3Aα7。     

Bt cry序列本地数据库的建立及本地BLAST的实现

根据研究的实际需要，运用winSDK设计了一个可视化的BLAST接口程序，利用此程序可以构建本地核酸和蛋白序列数据库与进行本地BLAST。在此基础上建立了苏云金芽孢杆菌（Bt）cry基因的本地核酸序列数据库，并进行了本地BLAST。与先前文献中介绍的本地BLAST实现的方法相比，此方法操作简便、并可根据实际需要随意定制相关数据库；在与NCBI的BLAST进行比较后发现，本地BLAST还具有个性化、准确性强、可信度高等特点。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区研究

为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)的最小活性区,根据NCBI BLAST比对结果与SWISS-MODEL同源建模结果,设计了12对截短引物,以cry9Aa3全长序列为模板,扩增出了12种不同截短片段,与pEB载体重组后的阳性克隆,转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Rosetta(DE3)诱导表达,提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定,发现截短蛋白Cry9Aa3-45~700、Cry9Aa3-1~654,对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性,其中截短蛋白Cry9Aa3-45~700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56μg/g,截短蛋白Cry9Aa3-1~654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79μg/g,与阳性对照无显著差异,而截短蛋白Cry9Aa3-1~653和Cry9Aa3-46~700(LC50200μg/g)对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同,最小活性区位于45I和654P之间。     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

几株具有杀虫特异性的苏云金芽胞杆菌菌株的生物活性及杀虫蛋白基因型的鉴定

通过在全国各地采集的土壤、腐殖质、水体固形物、动物排泄物,采用醋酸钠-硫酸庆大霉素培养基分离获得多样性的苏云金芽胞杆菌（Bt）菌株,利用cry基因的PCR-RELP鉴定体系对菌株进行基因分析,并用SDS-PAGE方法获得高晶体含量的菌株,用生物测定方法筛选对不同靶标昆虫高毒力的菌株,现已分别获得对甜菜娥、斜纹夜娥、松毛虫、茶树害虫茶尺蠖、水稻螟虫、榆蓝叶甲高效的Bt天然菌株。通过对Bt生物多样性的研究,针对不同害虫,有目的选择不同特色Bt菌株用于防治,或有防效菌株交互使用,达到最佳防治目标或延缓害虫抗性。     

转cry1Ah基因玉米对根际土壤微生物群落结构的影响

采用传统的平板计数法分析根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量;同时用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和BIOLOG方法,对转cry1Ah基因抗虫玉米根部土壤微生物群落结构进行了研究.结果表明,在玉米的整个生长过程中,根部可培养的微生物随时间变化有一定的消长,但同一时间内转基因玉米与非转基因玉米二者根...     

苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立

根据苏云金芽孢杆菌（Bt）cry2、cry3、cry4/cry10型基因的保守区分别设计了3对通用引物S5un2/S3un2、S5un3/S3un3和S5un4/S3un4。PCR扩增产生约1.2kb、1.4kb和1.5kb的产物,然后分别用HincⅡ/MspⅠ、Bg1Ⅱ/PstⅠ和BstEⅡ/DraⅠ酶切,并经RFLP分析鉴定Bt菌株的cry基因型。利用该方法对含已知cry2、cry3、和cry4/cry10型基因的Bt菌株和遗传工程菌进行基因分析,得到的结果与预测的RFLP相符,证明该方法可行。在此基础上对14株Bt分离株的基因型进行了鉴定,其中有9株分离株含cry2型基因;仅菌株Bt22含cry3型基因;所有被测菌株均不含cry4/cry10型基因。     

苏云金芽孢杆菌质粒复制区的分离克隆

Bt-E.coli穿梭载体pHT315去除Bt复制区,构成了一个具有红霉素和氨苄抗性,同时具有多克隆位点的只能存E.coli中复制的载体,命名为pHT315-1。利用pHT315-1,通过部分酶切建库的方法,从近10 000个重组子中得到1个Bt复制区。序列测定结果表明,该复制区为5273bps,已在GentBank注册,Accession number为AY278324。GenBank核酸序列Blast表明,该复制区部分序列与Bt菌株HD263的复制区。ori43编码复制蛋白的宁列同源性为98％。30℃连续培养72h,复制区质粒在Bt无晶体突变株HD73cry-中稳定性达98％以上,30h生长曲线也表明,该复制区质粒对受体菌株无明显不良影响。