广宿主稳定表达载体pQMV和pGMP的构建

以Eschedchia coli高效表达载体pET-29a为基础，将广宿主载体pUCP19中稳定的假单胞菌(Pseudomonas)质粒DNA复制子和自行分离克隆的荧光假单胞菌(P.fluorescens)P303组成型表达启动子PP303插入其中，分别获得了重组载体pQMV(4．6kb)和pGMP(5．6kb)。它们均含有假单胞菌和大肠杆菌复制子、荧光假单胞菌内源强启动子，以及包含8～11个限制性内切酶多克隆酶切位点；此外，载体pGMP还含有绿色荧光蛋白基因gfp作为辅助检测标记。连续培养和继代培养测定，这两种载体在荧光假单胞菌中的稳定性均为100％(120h)。     

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

 Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。     

浅谈3D打印的误差分析

本文从理论上介绍3D打印的基本原理,并系统的分析了成型的前期数据处理、成型加工过程和后处理三个阶段各因素对成型精度的影响。同时,提出了改进成型制件精度的措施和方法,对快速成型技术的发展有一定的指导意义。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

母细胞产生内含物的芽胞杆菌分析

在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)分离过程中发现有些芽胞杆菌产生与Bt相似的芽胞,但并不形成伴胞晶体,特别是发现它们在芽胞期的母细胞中含有丰富的内含物,对该类菌株的性质需要进一步明确.本研究选择6株该类型的菌株,对其种属、质粒、蛋白谱和杀虫活性等进行了初步分析.芽胞形态和质粒图谱分析结果显示,其与Bt菌株相似;肤指纹图谱分析发现选取的蛋白与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族细菌的蛋白匹配度最高;16S rDNA聚类研究表明,所分离的菌株的确与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族(包括Bc和Bt)同源性最高;从生物杀虫活性测定来看11-1菌株上清液对小菜蛾(Plutella xylostella)的校正死亡率达75.9％,而85-1和11-1菌株上清对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的校正死亡率分别能达到100％和87.9％.本研究结果表明在Bt菌株的分离过程中,对于没有形成晶体但在芽胞形成时期还有内含物的菌株也应加以重视,这些菌株属于B.cereus族,具有潜在利用价值.     

苏云金芽孢杆菌cry9Aa基因的克隆、表达及活性分析

为了解决目前广泛使用的cry1A类基因的抗性问题,获得对鳞翅目害虫高效杀虫基因,从菌株SC5D2和T03C001中鉴定并克隆到了2个新型cry9Aa基因,被Bt国际命名委员会分别正式命名为cry9Aa3和cry9Aa4,并进一步对其编码的蛋白进行活性测定。结果显示,2个基因对小菜蛾、玉米螟均具有较高的杀虫活性,其中对小菜蛾的LC50分别为1.83μg/mL和1.90μg/mL,对玉米螟的LC50分别为6.93μg/mL和1.06μg/mL。同时,两种Cry9Aa蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾都具有较高的杀虫活性,LC50分别为1.74μg/mL和1.39μg/mL,与敏感小菜蛾杀虫活性测定数据相当,表明Cry9Aa与Cry1Ac没有交互抗性。     

亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析

Cry9Ee是近年来发现的对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)等害虫具有高毒力的蛋白,具有良好的应用前景。为了明确亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白是否存在交互抗性,本文首先分别表达、活化、纯化了Cry9Ee和Cry1Ab蛋白,进而对敏感和Cry1Ab抗性亚洲玉米螟进行生物活性测定;随后对2种蛋白在敏感亚洲玉米螟中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,简称BBMVs)上的结合进行分析比较。生物活性测定结果表明,Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的活性片段对敏感亚洲玉米螟的LC₅₀分别为3.04和0.89 μg/g;而Cry9Ee活性片段在5.00 μg/g的浓度下,对Cry1Ab蛋白抗性亚洲玉米螟致死率高达96%,与对敏感种群活性相当。竞争结合试验表明,Cry9Ee和Cry1Ab两种蛋白间不存在竞争结合,推测它们在亚洲玉米螟中肠上存在不同的受体。综合生物活性测定及体外结合试验两方面结果得出结论：亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性。cry9Ee基因可以作为理想的候选基因,用于我国新一代转基因抗虫玉米的研制,为延缓和克服亚洲玉米螟对转基因抗虫玉米抗性的产生提供重要保证。     

苏云金杆菌Bt-59菌株Cry/Cyt毒素蛋白鉴定及杀虫活性

苏云金杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，Bti）是防治蚊幼虫的重要病原细菌，不同菌株间毒素蛋白种类和分布不尽相同。本研究利用苏云金杆菌以色列亚种Bt-59菌株的全基因组数据，对潜在的毒素基因种类、分布及菌株杀虫活性进行了分析。结果表明，Bt-59菌株除了含有Bti标准菌株主要毒素基因外，还含有Cry4-like基因，且Cry10Aa和Cyt1Ca基因在质粒4上发生了易位。质粒5上的Cry60Aa和Cry60Ba基因编码的毒素蛋白含有ETX_MTX2结构域，并与苏云金杆菌jegathesan亚种的同源蛋白一致性为100%。Cyt1Ca蛋白除了含有Bac_thur_toxin结构域外，还含有2个串联的RicinB_lectin_2结构域。菌株Bt-59对蚊幼虫具有较高的杀虫活性，对白纹伊蚊Aedes albopictus和淡色库蚊Culex pipiens pallens的LC₅₀分别为1.239 μL/L和0.341 μL/L。研究结果明确了菌株Bt-59毒素蛋白的种类和特征，为菌株遗传改良提供理论基础。     

ARDRA方法在荧光假单胞菌分离鉴定中的应用

【目的】探索荧光假单胞菌的分类方法，分离筛选拮抗性较强的荧光假单胞菌。【方法】利用紫外下产生荧光的特性，采用梯度稀释及鞭毛染色的方法，对采自云南、海南、山东和新疆的488份植物根际土壤进行分离筛选，分离菌株进行ARDRA分析，采用室内平板对峙法筛选对植物病原真菌具有较强拮抗作用的菌株，并对其进行生理生化分析和分子鉴定。【结果】分离筛选到102株紫外下产生荧光的杆状单极生鞭毛菌株。ARDRA分析产生荧光假单胞菌类型、恶臭假单胞菌类型以及一个未知的谱带类型。以油菜立枯病菌作为靶标菌，筛选到25株具有拮抗作用的菌株，其中TC222产生的抑菌圈最大，进一步的生测结果表明该菌株对9种重要的植物病原真菌如番茄灰霉病菌等具有很强的拮抗活性。TC222的 16S rDNA核苷酸序列与荧光假单胞菌PfO-1同源性达到99%，其最终鉴定为荧光假单胞菌。【结论】ARDRA方法在分子水平上为荧光假单胞菌的分离鉴定探索了一条新途径；TC222菌株具有拮抗多种植物病原真菌的能力，显示了良好的应用前景。     

苏云金芽孢杆菌HD-73菌株芽孢萌发条件的优化及质粒pHT73对芽孢萌发的影响

芽孢的萌发是芽孢杆菌从芽孢成长为营养体的第一步。在芽孢菌属中，有些菌株对人畜具有致病性。研究芽孢萌发过程对解析其致病性和生理功能至关重要。本文优化了苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）芽孢的萌发条件，确定芽孢萌发的适宜条件为：缓冲液为NaH2PO4（10mmol·L^-1）与NaCl（100mmol·L^-1）的混合物、pn值为7．2、萌发温度为37℃，萌发剂为肌苷或L-丙氨酸（1mmol·L^-1）与其它单一氨基酸（100mmol·L^-1，除酪氨酸和色氨酸为1mmol·L^-1）组成的混合物；利用该萌发条件，检测了苏云金芽孢杆菌菌株HD-73及其无晶体突变株HD-73^-在利用不同氨基酸途径中的芽孢萌发率差异，发现缺失质粒pHT73的无晶体突变株HD-73^-在肌苷与天冬氨酸和肌苷与谷氨酸为营养萌发剂的条件下，萌发率明显高于菌株HD-73，说明在质粒pHT73上可能存在对这两种途径起负调控作用的相关基因。